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信使RNA
單鏈核糖核酸
基本信息
| 中文名 | 信使RNA |
| 外文名 | mRNA |
| 模版 | DNA的一條鏈 |
| 性質(zhì) | 單鏈核糖核酸 |
| 學(xué)科 | 生物 |
概述
信使核糖核酸
信使RNA是指導蛋白質(zhì)生物合成的直接模板。mRNA 占細胞內RNA總量的2%~ 5%，種類(lèi)繁多，其分子大小差別非常大。
信使RNA（mRNA）是一大類(lèi)RNA分子，它將遺傳信息從DNA傳遞到核糖體，在那里作為蛋白質(zhì)合成模板并決定基因表達蛋白產(chǎn)物肽鏈的氨基酸序列。RNA聚合酶將初級轉錄物mRNA（稱(chēng)為前mRNA）轉錄成加工過(guò)的成熟mRNA，這種成熟的mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。
信使RNA
將密碼子翻譯成氨基酸的過(guò)程需要另外兩種類(lèi)型的RNA：轉移RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）。tRNA介導密碼子的識別并提供相應的氨基酸，rRNA是核糖體蛋白質(zhì)制造機械的核心組成部分。
mRNA的存在首先由Jacques Monod和Fran?oisJacob提出，隨后由Jacob，Sydney Brenner和Matthew Meselson于1961年在加州理工學(xué)院發(fā)現。
原核生物mRNA的轉錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，真核生物轉錄的mRNA前體則需經(jīng)轉錄后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結合生成信息體后才開(kāi)始工作。
原核與真核生物mRNA的結構特點(diǎn)也不同。真核生物mRNA具有5‘帽子和3’多聚A尾巴，原核生物沒(méi)有這樣的首尾結構。
單順?lè )醋优c多順?lè )醋觤RNA
翻譯產(chǎn)物僅是單個(gè)蛋白質(zhì)鏈（多肽）的mRNA稱(chēng)為單順?lè )醋觤RNA。大多數真核mRNA都屬于單順?lè )醋觤RNA。多順?lè )醋觤RNA攜帶幾個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），每個(gè)開(kāi)放閱讀框都能被翻譯成一條多肽，這些多肽通常具有相似的功能，通常構成最終復合蛋白的不同亞基。這些多肽鏈對應的DNA片斷則位于同一轉錄單位內，享用同一對起點(diǎn)和終點(diǎn)。細菌和古細菌中的大多數mRNA是多順?lè )醋拥摹?/span>
mRNA的環(huán)化
在真核生物中，由于eIF4E和poly（A）結合蛋白之間的相互作用，mRNA分子形成環(huán)狀結構，這兩種結合蛋白都與eIF4G結合，形成mRNA-蛋白-mRNA橋。環(huán)化促進(jìn)核糖體在mRNA上的循環(huán)，提高翻譯效率，且確保僅有完整的mRNA得到翻譯。
發(fā)現
儲存在DNA分子中的這種遺傳信息能在復制中產(chǎn)生更多的拷貝，并翻譯成蛋白質(zhì)。DNA的功能構成了信息的流動(dòng)，遺傳信息如何轉變成蛋白質(zhì)呢？轉錄就是其中的重要的一環(huán)。基因表達時(shí)以DNA的一條鏈為模板合成RNA，這一過(guò)程就是轉錄（transcription）。催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶（RNA polymerase）。RNA和DNA結構相似，所不同之處在于：⑴RNA一般以單鏈形式存在；⑵RNA中的核糖其C′-2不脫氧；⑶尿苷（U）取代了DNA中的胸苷。細胞中的RNA分成三種：mRNA（信使RNA），tRNA（轉運RNA）和rRNA（核糖體RNA）。它們的功能各不相同。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，tRNA是轉運特異氨基酸的運載工具，rRNA是合成蛋白質(zhì)的裝置。mRNA的堿基序列，決定著(zhù)蛋白質(zhì)裝配時(shí)氨基酸的序列。
1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲(chóng)進(jìn)行了實(shí)驗；若加入RNA酶降解細胞中的RNA，則蛋白質(zhì)合成就停止，若再加入從酵母中提取的RNA，則又可以重新合成一些蛋白質(zhì)，這就表明，蛋白質(zhì)的合成是依賴(lài)于RNA。
同年Goldstein和Plaut用同位素標記變形蟲(chóng)（Amoeba proteus）RNA前體，發(fā)現標記的RNA都在核內，表明RNA是在核內合成的。在標記追蹤（pulse-chase）實(shí)驗中，用短脈沖標記RNA前體，然后將細胞核轉移到未標記的變形蟲(chóng)中。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間發(fā)現被標記的RNA分子已在細胞質(zhì)中，這就表明RNA在核中合成，然后轉移到細胞質(zhì)內，而蛋白質(zhì)就在細胞質(zhì)中合成，因此RNA就成為在DNA和蛋白質(zhì)之間傳遞信息的信使的最佳候選者。
1956年Elliot Volkin和 Lawrence Astrachan作了一項很有意思的觀(guān)察：當E.coli被T2感染，迅速停止了RNA的合成，但噬菌的RNA卻開(kāi)始迅速合成。用同位素脈沖一追蹤標記表明噬菌的RNA在很短的時(shí)間內就進(jìn)行合成，但很快又消失了，表明RNA的半衰期是很短的。由于這種新合成的RNA的堿基比和T2的DNA堿基比相似，而和細菌的堿基比不同，所以可以確定新合成的RNA是T2的RNA。由于T2感染細菌時(shí)注入的是DNA，而在細胞里合成的是RNA，可見(jiàn)DNA是合成RNA的模板。最令人信服的證據來(lái)自DNA-RNA的雜交實(shí)驗。Hall.B.D和Spiegeman,S，將T2噬菌體感染E.coli后立即產(chǎn)生的RNA分離出來(lái)，分別與T2和E.coli的DNA進(jìn)行分子雜交，結果發(fā)現這種RNA只能和T2的DNA雜交形成“雜種”鏈，而不能和E.coli的DNA進(jìn)行雜交。表明T2產(chǎn)生的這種RNA（即mRNA）至少和T2的DNA中的一條鏈是互補的。
Brenner,s. Jacob,F.和Meselson(1961）進(jìn)行了一系列的的實(shí)驗（圖12-2），他們將E.coli培養在15N/13C的培養基中，因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所標記。也就是說(shuō)凡是“重”的核糖體，RNA和蛋白都是細菌的，然后用T2感染E.coli，細菌的RNA停止合成，而開(kāi)始合成T2的RNA此時(shí)用普通的“輕”培養基（14N/12C），但分別以32P來(lái)標記新合成的T2 RNA，以35S標記新合成的T2蛋白，因此任何重新合成的核糖體，RNA，及蛋白都是“輕”的但帶但有放射性同位素。經(jīng)培養一段時(shí)間后破碎細胞，加入過(guò)量的輕的核糖體作對照，進(jìn)行密度梯度離心，結果“輕”的核糖體上不具有放射性，“重”的核糖體上具有32P和35S，表明⑴T2未合成核糖體，“輕”核糖體卻是后加放的。⑵T2翻譯時(shí)是借用了細菌原來(lái)合成的核糖體，所以核糖體并無(wú)特異性，核糖體上結合的mRNA，其序列的特異性才是指導合成蛋白質(zhì)的遺傳信息，從而提出了mRNA作為“信使”的證據。因此他們將這種能把遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)上的物質(zhì)稱(chēng)為“信使”。他們預言⑴這種“信使”應是一個(gè)多核苷酸；⑵②其平均分子量不小于5′105（假定密碼比是3），足以攜帶一個(gè)基因的遺傳信息；⑶它們至少是暫時(shí)連在核糖體上；⑷其堿基組成反映了DNA的序列；⑸它們能高速更新。Volkin和Astrachan發(fā)現高速更新的RNA似乎完全符合以上條件。Jacob和Monod將它定名為信使RNA（Messenger RNA）或mRNA。
合成與加工
轉錄
轉錄是指由DNA合成RNA的過(guò)程。在轉錄期間，RNA聚合酶根據需要將一個(gè)基因的DNA拷貝成mRNA，這個(gè)過(guò)程在真核生物和原核生物中是相似的。
與原核生物明顯不同的是，真核RNA聚合酶在轉錄過(guò)程中與mRNA加工酶結合，因此，真核生物的mRNA加工可以在轉錄開(kāi)始后快速進(jìn)行。短壽命的未加工或部分加工的轉錄產(chǎn)品稱(chēng)為前體mRNA或pre-mRNA；一旦加工完全，它被稱(chēng)為成熟mRNA。
真核pre-mRNA加工
mRNA的加工在真核生物、細菌和古細菌中差異很大。實(shí)質(zhì)上，非真核mRNA在轉錄時(shí)是成熟的，除極少數情況外不需要加工。然而，真核pre-mRNA需要大量加工。
5’端加帽子：5‘ 帽（也稱(chēng)為RNA帽，RNA 7-甲基鳥(niǎo)苷帽或RNA m7G帽）就是一個(gè)經(jīng)修飾的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，在轉錄開(kāi)始不久后就被添加到新產(chǎn)生的真核mRNA的“前”即5'末端。 5’帽由末端7-甲基鳥(niǎo)苷殘基組成，它通過(guò)5'-5'-三磷酸鍵與第一轉錄出的核苷酸連接。它的存在對于核糖體的識別和對mRNA的保護至關(guān)重要。
3’端加尾：是指聚腺苷酰基部分與mRNA分子的共價(jià)連接。在真核生物中，大多數信使RNA（mRNA）分子在3'末端被多聚腺苷酸化。Poly A尾巴和與其結合的蛋白質(zhì)有助于保護mRNA免于被核酸外切酶降解。3’端加尾對于轉錄終止，從細胞核輸出mRNA和翻譯也很重要。 原核生物中的mRNA也常被3’端加尾，但此時(shí)的poly（A）尾巴促進(jìn)而不是防止核酸外切酶對mRNA的降解。
mRNA的轉運
真核生物和原核生物之間的另一個(gè)區別是mRNA的轉運。由于真核轉錄和翻譯是在不同的細胞器內進(jìn)行的，真核mRNA必須從細胞核輸出到細胞質(zhì)。 這一過(guò)程可能受不同信號通路的調節。成熟的mRNA通過(guò)其加工的修飾被識別，在結合帽結合蛋白CBP20和CBP80及轉錄/輸出復合物（TREX）后通過(guò)核孔被輸出到細胞質(zhì)。
mRNA的翻譯
因為原核mRNA不需要加工或轉運，所以原核生物mRNA在核糖體的翻譯可以在轉錄結束后立即開(kāi)始。因此，可以說(shuō)原核生物的mRNA翻譯與轉錄偶聯(lián)發(fā)生。
已經(jīng)加工并轉運至細胞質(zhì)的真核mRNA（即成熟mRNA）在核糖體的翻譯發(fā)生在細胞質(zhì)中自由漂浮的核糖體中，或者通過(guò)信號識別顆粒導向到的內質(zhì)網(wǎng)中。因此，與原核生物不同，真核生物的mRNA翻譯不直接與轉錄偶聯(lián)。在某些情況下甚至可能發(fā)生這樣的情況，即mRNA水平的降低卻伴隨著(zhù)蛋白質(zhì)水平的增加。
相關(guān)課程
第一節DNA轉錄生成RNA
一、定義
一轉錄單位
二、RNA聚合酶
二酶的分類(lèi)：
2．細菌則具有復雜的多亞基結構（450Kd），可識別并轉錄超過(guò)1000個(gè)轉錄單位。
3．真核生物的酶有多種，根據a－鵝膏蕈堿（環(huán)狀8肽，阻斷RNA延伸）的抑制作用可分為三類(lèi)：聚合酶A對它不敏感，分布于核仁，轉錄核糖體RNA；聚合酶B對低濃度敏感，存在于核質(zhì)，轉錄信使RNA；聚合酶C位于核質(zhì)，對高濃度敏感，轉錄小分子量RNA，如轉運RNA、5SRNA等。各種RNA聚合酶都是由10-15種不同亞基組成的多亞基復合物。
三酶的構成：大腸桿菌的全酶有5個(gè)亞基（α2ββ’ωσ），含2個(gè)鋅。β催化形成磷酸二酯鍵，β’結合模板，σ亞基稱(chēng)為起始因子，可使RNA聚合酶穩定地結合到啟動(dòng)子上。ββ’ωσ稱(chēng)為核心酶。σ亞基在不同菌種間變動(dòng)較大，而核心酶比較恒定。酶與不同啟動(dòng)子的結合能力不同，不同啟動(dòng)因子可識別不同的啟動(dòng)子。σ70識別啟動(dòng)子共有序列，σ32識別熱休克基因，σ60在氮饑餓時(shí)起作用。σ通過(guò)隨機移動(dòng)起作用，不需解鏈。
三、轉錄過(guò)程
分為起始、延長(cháng)和終止三個(gè)階段。起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個(gè)核苷酸間形成磷酸二酯鍵。第一個(gè)核苷酸摻入的位置稱(chēng)為轉錄起點(diǎn)。
起始后起始因子離開(kāi)，核心酶構象改變，沿模板移動(dòng)，轉錄生成雜交雙鏈（12bp）。隨后DNA互補鏈取代RNA鏈，恢復DNA雙螺旋結構。延伸速度為50nt/s，酶移動(dòng)17nm。錯誤幾率為10-5。
聚合酶到達終點(diǎn)時(shí)，在終止輔助因子的幫助下停止反應，酶和RNA鏈脫落，轉錄結束。
四、啟動(dòng)子和轉錄因子
二原核生物：大腸桿菌在起點(diǎn)上游約－10堿基對處有保守序列TATAAT，稱(chēng)為pribnow box，有助于局部解鏈。在其上游還有TTGACA，稱(chēng)為－35序列，提供RNA聚合酶識別的信號。
三真核生物：復雜，差異較大。
1．信使RNA的啟動(dòng)子通常有三個(gè)保守區，－25到－30有TATA框，是解鏈位置，并決定轉錄起點(diǎn)；－75位置有CAAT框，與RNA聚合酶的結合有關(guān)；更上游還有GC框，某些轉錄因子可結合。后兩個(gè)稱(chēng)為上游因子，對轉錄起始頻率有較大影響；
2． 小RNA的啟動(dòng)子在轉錄區內部，有一些輔助因子幫助RNA聚合酶識別。
五、終止子和終止因子
一定義
1． 簡(jiǎn)單終止子，回文區有一段富含GC對的序列，回文后有寡聚尿苷。
三某些因子可使酶越過(guò)終止子繼續轉錄，稱(chēng)為通讀。常見(jiàn)于某些噬菌體的時(shí)序控制，早期基因與晚期基因以終止子相隔，早期基因產(chǎn)生抗終止因子，使發(fā)生通讀以表達晚期基因。
六、轉錄的調控
一遺傳信息的表達有時(shí)序調控和適應調控，轉錄水平的調控是關(guān)鍵環(huán)節，因為這是表達的第一步。轉錄調控主要發(fā)生在起始和終止階段。
二操縱子是細菌基因表達和調控的單位，有正調節和負調節因子。阻遏蛋白的作用屬于負調控。環(huán)腺苷酸通過(guò)其受體蛋白（CRP）促進(jìn)轉錄，可促進(jìn)許多誘導酶的合成。操縱子可構成綜合性調控網(wǎng)絡(luò )，如SOS反應等。對終止子也有調控作用，如衰減子。
第二節轉錄后加工
一、原核生物
一核糖體RNA：大腸桿菌共有7個(gè)核糖體RNA的轉錄單位，每個(gè)轉錄單位由16S、23S、5SRNA和若干轉運RNA基因組成。16S和23S之間常由轉運RNA隔開(kāi)。轉錄產(chǎn)物在RNA酶III的作用下裂解產(chǎn)生核糖體RNA的前體P16和P23，再由相應成熟酶加工切除附加序列。前體加工時(shí)還進(jìn)行甲基化，產(chǎn)生修飾成分，特別是a-甲基核苷。N4,2’-O二甲基胞苷（m4Cm）是16S核糖體RNA特有成分。5S核糖體RNA一般無(wú)修飾成分。
二轉運RNA：有60個(gè)基因，其加工包括：
1．內切酶在兩端切斷，大腸桿菌RNA酶P是5’成熟酶；
3．3’端加上CCAOH，由轉運RNA核苷酰轉移酶催化，某些轉運RNA已有，切除附加序列后即露出；
三信使RNA：細菌多數不用加工，轉錄與翻譯是偶聯(lián)的。也有少數多順?lè )醋有攀筊NA必須由內切酶切成較小的單位，然后翻譯。如核糖體大亞基蛋白與RNA聚合酶的b亞基基因組成混合操縱子，轉錄后需經(jīng)RNA酶III切開(kāi)，各自翻譯。因為RNA聚合酶的合成水平低得多，切開(kāi)有利于各自的翻譯調控。較長(cháng)的RNA會(huì )產(chǎn)生高級結構，不利于翻譯，切開(kāi)可改變其結構，從而影響其功能。
二、真核生物
一核糖體RNA：基因拷貝數多，在幾十到幾千之間。基因成簇排列在一起，由RNA聚合酶I轉錄生成一個(gè)較長(cháng)的前體，哺乳動(dòng)物為45S。核仁是rRNA合成與核糖體亞基生物合成的場(chǎng)所。RNA酶III等核酸內切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III轉錄，經(jīng)加工參與構成大亞基。核糖體RNA可被甲基化，主要在核苷2’羥基，比原核生物甲基化程度高。多數核糖體RNA沒(méi)有內含子，有些有內含子但不轉錄。
二轉運RNA：由RNA聚合酶III轉錄，加工與原核相似，但3’端的CCA都是后加的，還有2’-O-甲基核糖。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因以單個(gè)基因為轉錄單位，但有內含子，需切除。信使RNA的原初轉錄產(chǎn)物是分子量很大的前體，在核內加工時(shí)形成大小不等的中間物，稱(chēng)為核內不均一RNA(hnRNA）。其加工過(guò)程包括：
1．5’端加帽子：在轉錄的早期或轉錄終止前已經(jīng)形成。首先從5’端脫去一個(gè)磷酸，再與GTP生成5’，5’三磷酸相連的鍵，最后以S-腺苷甲硫氨酸進(jìn)行甲基化，形成帽子結構。帽子結構有多種，起識別和穩定作用。
三、RNA的拼接
一轉運RNA的拼接：由酶催化，酶識別共同的二級結構，而不是序列。通常內含子插入到靠近反密碼子處，與反密碼子配對，取代反密碼子環(huán)。第一步由內切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA連接酶連接，需要ATP。
二四膜蟲(chóng)核糖體RNA的拼接：某些四膜蟲(chóng)26S核糖體RNA基因中有一個(gè)內含子，其拼接只需一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子及鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷存在即可自發(fā)進(jìn)行。其實(shí)質(zhì)是磷酸酯的轉移反應，鳥(niǎo)苷酸起輔助因子的作用，提供游離3’羥基。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質(zhì)的核基因的內含子屬于第二類(lèi)內含子，左端為GT，右端為AG。先在左端切開(kāi)，產(chǎn)生的5’末端與3’端上游形成5’，2’-磷酸二酯鍵，構成套索結構。然后內含子右端切開(kāi)，兩個(gè)外顯子連接起來(lái)。通過(guò)不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。
第三節RNA的復制
一、噬菌體QbRNA的復制
其RNA是單鏈，正鏈，侵入大腸桿菌后立即翻譯，產(chǎn)生復制酶的b亞基，與宿主的三個(gè)亞基（α為核糖體蛋白，γ、δ均為肽鏈延長(cháng)因子）構成復制酶，進(jìn)行復制。先以正鏈為模板合成負鏈，再根據負鏈合成正鏈。合成負鏈時(shí)需要宿主的兩個(gè)蛋白因子，合成正鏈則不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白質(zhì)合成受RNA高級結構的調控。
二、病毒RNA復制的主要方式
一病毒含正鏈RNA，先合成復制酶，復制后合成其他蛋白質(zhì)進(jìn)行裝配。如噬菌體Qb及灰質(zhì)炎病毒。
第四節RNA生物合成的抑制劑
一、堿基類(lèi)似物
有些人工合成的堿基類(lèi)似物能干擾和抑制核酸的合成。作用方式有以下兩類(lèi)：
一作為代謝拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有關(guān)酶類(lèi)。如6-巰基嘌呤進(jìn)入體內后可轉變?yōu)閹€基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作為抗癌藥物，治療急性白血病等。此類(lèi)物質(zhì)一般需轉變?yōu)橄鄳暮塑账岵拍鼙憩F出抑制作用。
二進(jìn)入核酸分子，形成異常RNA或DNA，影響核酸的功能并導致突變。5-氟尿嘧啶類(lèi)似尿嘧啶，可進(jìn)入RNA，與腺嘌呤配對或異構成烯醇式與鳥(niǎo)嘌呤配對，使A-T對轉變?yōu)镚-C對。因為正常細胞可將其分解，而癌細胞不能，所以可選擇性抑制癌細胞生長(cháng)。
二、DNA模板功能抑制物
二放線(xiàn)菌素類(lèi)：可與DNA形成非共價(jià)復合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。
三、RNA聚合酶抑制劑
一利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。
二利鏈菌素：與細菌RNA聚合酶b亞基結合，抑制RNA鏈的延長(cháng)。
mRNA分子的合成始于轉錄，并最終以降解結束。在被翻譯之前，真核mRNA分子通常需要大量加工和轉運，而原核mRNA分子則不需要。真核mRNA分子和它周?chē)牡鞍踪|(zhì)一起被稱(chēng)為信使RNP。
實(shí)驗方法
對mRNA的檢測、分析及定量 | ||||
方法 | 目標RNA的類(lèi)型 | 同時(shí)定量的目標RNA的數量 | 用途 | 缺點(diǎn) |
Northern雜交 | mRNA | 通常為一個(gè)，最多幾個(gè)。 | 主要用于估測不同組織、細胞中目標mRNA的分子質(zhì)量，可用于mRNA的粗略定量。 | 需要大量RNA；只可同時(shí)檢測一個(gè)或最多幾個(gè)mRNA；與PCR方法相比，靈敏度差、耗時(shí)。 |
RNA酶保護 | mRNA | 通常為一個(gè)，但是如果使用混合探針，最多可同時(shí)檢測12種mRNA。 | 主要用于對不同類(lèi)型細胞或組織中目標mRNA的檢測和定量。 | 需要特異性的反義雜交探針（通常帶放射性）。RNA酶保護法遠比Northern雜交靈敏，但靈敏度還是不如PCR法。 |
傳統反轉錄PCR | mRNA | 通常為一個(gè)，但是也可努力做到多重檢測系統。 | ||
實(shí)時(shí)定量PCR | mRNA及miRNA | 通常為一個(gè)，但也可檢測多個(gè)目標RNA，參見(jiàn)Stanley和Szewczuk（2005）等的研究結果，他們在單個(gè)多重反應中同時(shí)分析過(guò)72個(gè)mRNA。 | 是檢測目標RNA的一種高靈敏及高精度的方法。即使目標RNA在細胞中拷貝數極少也適用。實(shí)時(shí)PCR比其他方法更靈敏、更快、更精確。最近10年內是檢測細胞中mRNA相對豐度的主要方法。不僅可用于mRNA的檢測，也可用于microRNA的檢測（參見(jiàn)Chen et al. 2005；Benes and Castoldi 2010）。 | 市場(chǎng)上銷(xiāo)售的幾種商業(yè)設備采用的檢測方法不同。另外，已出版了數百種描述實(shí)時(shí)定量PCR的方案。實(shí)時(shí)PCR的每個(gè)步驟都缺乏標準，導致可靠性和可重復性的比較即使可能，也很困難（Nolanet al. 2006；Derveaux etal. 2010）。對實(shí)時(shí)PCR提出了一些合理的建議和標準，規定了實(shí)時(shí)PCR結果發(fā)表所必需的最少信息量，也許會(huì )有助于解決目前的困境（Bustinet al. 2009；Bustin 2010）。 |
降解
同一細胞內的不同mRNA具有不同的壽命（穩定性）。在細菌細胞中，單個(gè)mRNA可以存活數秒至超過(guò)一小時(shí)，但平均壽命為1至3分鐘，因此，細菌mRNA的穩定性遠低于真核mRNA。哺乳動(dòng)物細胞mRNA的壽命從幾分鐘到幾天不等。mRNA的穩定性越高，從該mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)越多。 mRNA的有限壽命使細胞能夠快速改變蛋白質(zhì)合成以響應其不斷變化的需求。有許多機制可導致mRNA的降解。
真核mRNA的降解
真核細胞的翻譯和mRNA衰變之間存在著(zhù)平衡。正在被翻譯的mRNA被核糖體，真核起始因子eIF-4E和eIF-4G以及poly（A）結合蛋白結合，不能接觸外泌體復合物，mRNA得到保護。mRNA的poly（A）尾巴被特異性外切核酸酶縮短，該核酸外切酶通過(guò)RNA上的順式調節序列和反式作用RNA結合蛋白的組合定位到特定mRNA。 Poly（A）尾巴被去除破壞了mRNA的環(huán)狀循環(huán)結構并降低了帽結合復合體的穩定性，導致mRNA會(huì )被外來(lái)體復合物或脫帽復合物降解。通過(guò)這種方式，可以快速降解翻譯不活躍的mRNA，而翻譯活躍的mRNA不受影響。
小干擾RNA
在后生生物中，由Dicer產(chǎn)生的小干擾RNA（siRNA）被整合到稱(chēng)為RNA誘導沉默復合物（RISC）。該復合物含有內切核酸酶，切割與siRNA結合的完全互補的mRNA，產(chǎn)生的片段然后被核酸外切酶降解。 siRNA通常用于實(shí)驗室細胞培養中阻斷基因的功能。SiRNA被認為是病毒先天免疫系統的一部分，可以用于對雙鏈RNA病毒的防御。
微小RNA
微小RNA（miRNA）是小RNA，通常與后生生物mRNA中的序列部分互補。 miRNA與mRNA的結合可以抑制該mRNA的翻譯并加速poly（A）尾部去除，從而加速mRNA降解。
結構與功能
從 (DNA）轉錄合成的帶有遺傳信息的一類(lèi)單鏈（RNA），他作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定了核糖體合成肽鏈的種類(lèi)。1961年F.雅各布和根據大腸桿菌誘導酶生成的實(shí)驗結果提出：信息從DNA到蛋白質(zhì)之間的轉移，必需有一種RNA起傳遞作用，由此提出了信使核糖核酸的名稱(chēng)。
生物體內的每種多肽鏈都由特定的mRNA編碼，所以細胞內mRNA的種類(lèi)很多，但通常每種mRNA的拷貝數極少（1～10個(gè)）。根據信息密碼學(xué)說(shuō)，3個(gè)連續的核苷酸可以編碼一個(gè)氨基酸，因此從已知mRNA（或DNA）核苷酸順序可以準確推導出蛋白質(zhì)的一級結構。
存在范圍和性質(zhì)
mRNA存在于原核和真核生物的細胞質(zhì)及真核細胞的某些細胞器（如和）中。RNA病毒和RNA噬菌體中的 RNA既是遺傳信息的載體又具有mRNA的功能。生物體mRNA種類(lèi)的多少與生物進(jìn)化水平有關(guān)，高等生物所含的遺傳信息多，mRNA的種類(lèi)也多。生物體內某種mRNA的含量根據需要而有不同，如5齡蠶后部絲腺體的主要任務(wù)是快速合成大量絲心蛋白，因而編碼絲心蛋白的mRNA含量特別多。有些細菌需要不斷適應外部環(huán)境，其體內編碼某些誘導酶的mRNA的含量也較多。
原核和真核生物mRNA不同的特點(diǎn)
①原核生物mRNA常以多順?lè )醋樱ㄒ?jiàn)）的形式存在，即一條mRNA鏈編碼幾種功能相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。真核生物mRNA一般以單順?lè )醋拥男问酱嬖冢匆环NmRNA只編碼一種蛋白質(zhì)。②原核生物mRNA的轉錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，即轉錄尚未完畢，蛋白質(zhì)的轉譯合成就已開(kāi)始 真核生物轉錄的mRNA前體則需經(jīng)后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結合生成信息體后才開(kāi)始工作 信息體中蛋白質(zhì)與RNA之比約為3。③原核生物mRNA半壽期很短，一般為幾分鐘，最長(cháng)只有數小時(shí)（RNA噬菌體中的RNA除外）。真核生物mRNA的半壽期較長(cháng)，如胚胎中的mRNA可達數日。④原核與真核生物mRNA的結構特點(diǎn)也不同。
一級結構與功能的關(guān)系
原核生物mRNA一般5'端有一段不翻譯區，稱(chēng)前導順序，3'端有一段不翻譯區，中間是蛋白質(zhì)的編碼區，一般編碼幾種蛋白質(zhì)。如大腸桿菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈；色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈。也有單順?lè )醋有问降募毦鷐RNA，如大腸桿菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般沒(méi)有修飾核苷酸，也沒(méi)有5'端帽子結構和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密碼子（AUG）附近（5'方向上游）的一小段長(cháng)短不等的順序，含有較多的嘌呤核苷酸，被稱(chēng)為SD順序。它能和核糖體小亞基上的16SrRNA的3'端富含嘧啶核苷酸的區域配對結合，有助于帶有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA識別mRNA上的起始密碼（AUG），使肽鏈合成從此開(kāi)始。這段順序是1974年由J.夏因和L.達爾加諾發(fā)現的，所以稱(chēng)為SD順序，也稱(chēng)核糖體結合部位。原核生物mRNA的編碼區一般編碼幾種功能上相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，兩種蛋白質(zhì)的編碼區之間常有一小段不翻譯的順序，叫做間隔區。有的噬菌體RNA中2個(gè)相鄰的順?lè )醋?/a>共用一段相同的編碼順序，例如，M 噬菌體RNA中的溶菌蛋白編碼區共225個(gè)核苷酸中有189個(gè)核苷酸是由相鄰兩個(gè)蛋白質(zhì)共用的。原核mRNA與真核mRNA一樣使用同一套三聯(lián)體密碼子（真核生物線(xiàn)粒體mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操縱子mRNA的5' 端前導順序上有一段順序稱(chēng)作弱化子。弱化子具有兩種可以互變的構象，其中一種構象是轉錄終止的信號，能使轉錄中止（或衰減）。衰減調節是原核生物合成氨基酸的調控方式之一（見(jiàn)）。
真核生物 mRNA（細胞質(zhì)中的）一般由5'端帽子結構、5'端不翻譯區、翻譯區（編碼區）、3'端不翻譯區和3'端聚腺苷酸尾巴構成（圖1a[真核生物mRNA結構示意圖 a一級結構示意圖]）。分子中除 G構成帽子外，常含有其他修飾核苷酸，如 A等。5'端帽子結構通常有3種類(lèi)型，即：G(5'）ppp(5')N； G(5')ppp(5') N和 G(5')ppp(5'） N。圖1b[真核生物mRNA結構示意圖b 5'端帽子結構式，，表示堿基]，表示堿基" class=image>[] 是帽子的化學(xué)結構，N右邊的m代表核糖2'位羥基的甲基化。真核細胞線(xiàn)粒體中的mRNA無(wú)帽子結構。一般認為帽子的功能與翻譯的啟動(dòng)有關(guān)。許多真核生物 mRNA（如珠蛋白mRNA）除去帽子后翻譯效率大大降低。5'端不翻譯區，也叫前導順序。不同的真核mRNA的前導順序長(cháng)度不同，有的只有10個(gè)核苷酸，有的則有200個(gè)核苷酸。與原核mRNA相似，真核mRNA5'端不翻譯區中常有一段順序與核糖體小亞基上的18SrRNA的3'端的一段順序互補并結合，這種結合與真核mRNA的翻譯啟動(dòng)有關(guān)。
翻譯區（編碼區）使用的密碼子除線(xiàn)粒體（如人、牛和酵母線(xiàn)粒體）外與原核生物mRNA是一樣的。真核生物mRNA的起始密碼子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密碼子也都有“簡(jiǎn)并現象”，即幾種不同的密碼子翻譯出同一種氨基酸，但不同的mRNA中簡(jiǎn)并密碼子的利用率是不同的，真核與原核生物之間的差別就更大。mRNA的終止密碼子有3個(gè)（UAG、UGA和UAA），其功能是停止翻譯，一般只用一個(gè)終止密碼子就能使翻譯停止。有的mRNA有2個(gè)連續的終止密碼子（見(jiàn)）。3'端不翻譯區的長(cháng)短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39個(gè)核苷酸，而卵白蛋白mRNA則有637個(gè)核苷酸。真核生物mRNA3'端不翻譯區常有 AAUAA(A）或AUUUA(A）等順序，它們和識別多聚A聚合酶及裝配多聚A尾巴有關(guān)。除個(gè)別組蛋白mRNA外，真核生物mRNA3'端均有多聚A尾巴 3'端多聚A尾巴的長(cháng)度隨來(lái)源不同而不同，且隨mRNA的老化而變短，通常有20～200個(gè)A。多聚A與mRNA穩定性及mRNA從細胞核轉到細胞漿中有關(guān)。
真核生物mRNA的前體 真核生物mRNA通常都有相應的前體。從DNA轉錄產(chǎn)生的原始轉錄產(chǎn)物可稱(chēng)作原始前體（或mRNA前體）。一般認為原始前體要經(jīng)過(guò)hnRNA核不均-RNA的階段，最終才被加工為成熟的 mRNA。hnRNA上的蛋白質(zhì)編碼區被一些居間順序分隔成若干段；不同的基因轉錄產(chǎn)物所含的居間順序的數目不同，人胰島素只有兩個(gè)，而牛眼的晶體蛋白則含有數十個(gè)；居間順序的長(cháng)短也各不相同，從數十個(gè)到上千個(gè)核苷酸（雞卵白蛋白有一個(gè)1550個(gè)核苷酸的居間順序）。居間順序將在剪接過(guò)程中去除。約有10～40%的hnRNA含有3′端多聚A尾巴。hnRNA經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工切除居間順序并把分隔的蛋白質(zhì)編碼區連接起來(lái)，最終成為成熟的mRNA。
二級結構與功能的關(guān)系
DNA表達的信息需轉給一種“信使RNA”
真核生物mRNA也具有豐富的二級結構，如鴨珠蛋白mRNA和兔珠蛋白mRNA分別有45～60%和55～62%的核苷酸殘基處在堿基配對之中。在真核生物蛋白質(zhì)啟動(dòng)復合物中，40S核糖體實(shí)際上覆蓋著(zhù)mRNA上包括帽子結構在內的50～54個(gè)核苷酸，但是40S核糖體的大小比50個(gè)核苷酸的長(cháng)度小得多 由于形成的發(fā)夾結構（二級結構使帽子與起始密碼子之間的空間距離縮短）（圖3[真核生物mRNA ]），造成40S核糖體能夠覆蓋包括帽子結構和起始密碼子 AUG在內的50多個(gè)核苷酸，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成。不同的mRNA中發(fā)夾結構的有無(wú)或多少各不相同。在蛋白質(zhì)合成肽鏈繼續延伸時(shí)，不需要帽子結構參加，此時(shí)核糖體覆蓋的mRNA的區域約為25～35個(gè)核苷酸，mRNA的構象已不同于啟動(dòng)階段而是處于一種伸展的狀態(tài)，從而有利于轉譯的延續。可見(jiàn)，折疊起來(lái)的mRNA二級結構有利于蛋白質(zhì)合成的啟動(dòng)，以后mRNA處于伸展的狀態(tài)則有利于轉譯的繼續。
信使與密碼子
簡(jiǎn)介
遺傳信息從DNA分子抄錄到RNA分子中的過(guò)程稱(chēng)為轉錄（transcription）。在真核生物中，最初轉錄生成的RNA稱(chēng)為核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），然而在細胞漿中起作用，作為蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成模板的是mRNA（messenger RNA）。hnRNA是mRNA的未成熟前體。兩者之間的差別主要有兩點(diǎn)：一是hnRNA核苷酸鏈中的一些片段將不出現于相應的mRNA中，這些片段稱(chēng)為內含子（intron），而那些保留于mRNA中的片段稱(chēng)為外顯子（exon）。也就是說(shuō)，hnRNA在轉變?yōu)閙RNA的過(guò)程中經(jīng)過(guò)剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新連接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一個(gè)m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一個(gè)多聚腺苷酸（polyA）尾巴。mRNA從5′末端到3′末端的結構依次是5′帽子結構，5′末端非編碼區，決定多肽氨基酸序列的編碼區，3′末端非編碼區，和多聚腺苷酸尾巴。多聚腺苷酸尾一般由數十個(gè)至一百幾十個(gè)腺苷酸連接而成。隨著(zhù)mRNA存在時(shí)間的延續，這段聚A尾巴慢慢變短。因此，目前認為這種3′末端結構可能與增加轉錄活性以及使mRNA趨于相對穩定有關(guān)。原核生物的mRNA沒(méi)有這種首、尾結構。
1961年，Jacob和Monod首先提出了mRNA的概念。在真核細胞中，由于蛋白質(zhì)是在胞漿中而不是在核內合成，因此顯然要求有一個(gè)中間物將DNA上的遺傳信息傳遞至胞漿中。后來(lái)的研究證實(shí)，這種中間物即信使RNA.?mRNA的核苷酸序列與DNA序列相應，決定著(zhù)合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。它如何指導氨基酸以正確的順序連接起來(lái)呢？不同的mRNA堿基組成和排列順序都不同，但都只有A，G，C，U4種堿基。如果一個(gè)堿基就可以決定一個(gè)氨基酸，則只有四種變化方式，如果兩個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸，則只有16種變化方式，都不能滿(mǎn)足20種氨基酸的需要。1961年Crick和Brenner的實(shí)驗得出了三個(gè)核苷酸編碼一個(gè)氨基酸的結論，并將這種三位一體的核苷酸編碼稱(chēng)做遺傳密碼（genetic code）或三聯(lián)體密碼，這樣就可以有64種不同的密碼，但此情況下必須假定有一些氨基酸使用兩個(gè)以上的密碼。這一假定很快就被證明是對的。
遺傳密碼具特征
1．三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，每個(gè)密碼子由三個(gè)前后相聯(lián)的核苷酸組成，一個(gè)密碼子只為一種氨基酸編碼。共有64個(gè)密碼子；
2．密碼子之間不重疊使用核苷酸，也無(wú)核苷酸間隔；
3．一種氨基酸可有多個(gè)密碼子，這個(gè)特點(diǎn)稱(chēng)為密碼子的簡(jiǎn)并性；
4．密碼子的通用性，所有生物從最低等的病毒直至人類(lèi)，蛋白質(zhì)合成都使用同一套密碼子表（表15-8），僅有極少的例外，如特殊細胞器線(xiàn)粒體，葉綠體所用的密碼稍有不同。
通用遺傳密碼及相應的氨基酸
第一個(gè)核苷酸5′ 第二個(gè)核苷酸 第三個(gè)核苷酸3′
U C A G
苯丙氨酸 絲氨酸 酪氨酸半胱氨酸 C
亮氨酸 絲氨酸 終止碼 終止碼 A
亮氨酸 絲氨酸 終止碼 色氨酸 G
亮氨酸 脯氨酸 組氨酸 精氨酸 C
亮氨酸 脯氨酸谷氨酰胺 精氨酸 A
亮氨酸 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 G
異亮氨酸 蘇氨酸 天冬酰胺 絲氨酸 C
異亮氨酸 蘇氨酸 賴(lài)氨酸 精氨酸 A
蛋氨酸 蘇氨酸 賴(lài)氨酸 精氨酸 G
纈氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸 C
纈氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 A
纈氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 G
密碼子 通用編碼 線(xiàn)粒體編碼
UGA 終止碼 色氨酸 色氨酸 色氨酸 終止碼
AUA 異亮氨酸 蛋氨酸 蛋氨酸 蛋氨酸 異亮氨酸
CUA 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 蘇氨酸 亮氨酸
AGA 精氨酸 終止碼 絲氨酸 精氨酸 精氨酸
注：下標橫線(xiàn)者為與通用編碼不同的編碼
究竟哪一個(gè)密碼子為哪一種氨基酸編碼，即密碼子與氨基酸之間的對應關(guān)系已在60年代研究解決了。1964年Nirenberg用一種RNA聚合酶體外合成了多聚尿苷酸、多聚腺苷酸等多聚核苷酸，將這些多聚核苷酸分別用于蛋白質(zhì)的體外合成。發(fā)現，當所用的多聚核苷酸為多聚尿苷酸時(shí)，只有多聚苯丙氨酸合成，這意味著(zhù)UUU為苯丙氨酸編碼；用其它多聚核苷酸進(jìn)行相應的實(shí)驗后發(fā)現，CCC為脯氨酸編碼，而AAA為賴(lài)氨酸編碼；其后，有人又用核苷酸比例為已知，但是核苷酸序列隨機的多聚核苷酸，以及用已知序列的含兩種或兩種以上核苷酸的多聚核苷酸進(jìn)行相應的實(shí)驗，將結果加以數理統計處理，又解讀了一批密碼子，其中包括三個(gè)終止碼，最后，還有一些密碼子是通過(guò)合成已知序列的三聚核苷酸與核蛋白體和載有放射性同位素標記的氨基酸的tRNA共沉淀原理予以解讀的。在所有密碼子中，AUG不僅為蛋氨酸編碼，而且又是翻譯（translation，以mRNA上的遺傳信息指導核蛋白體上多肽鏈合成的過(guò)程）的起始信號，UAA、UAG和UGA不為任何氨基酸編碼，而是作為翻譯的終止信號，統稱(chēng)為終止碼（stop codon），又常被叫作無(wú)意義碼（nonsense codon）。
大多數氨基酸是由一個(gè)以上的密碼子所編碼。這個(gè)事實(shí)提出了一個(gè)問(wèn)題：編碼同一種氨基酸的一組密碼子的使用頻率是否都相同？細致的分析表明，無(wú)論是原核生物，還是高等真核生物，密碼子的使用頻率并不是平均的，有些密碼子的使用率很高，有些則幾乎不使用，其使用頻率主要與細胞內tRNA含量呈正相關(guān)。
傳遞
簡(jiǎn)介
轉錄是在原核和真核細胞中以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。
在原核和真核生物中，轉錄過(guò)程是相似的。包括DNA變性，RNA聚合酶結合在單鏈DNA上以5′→3′方向合成RNA分子。雙鏈中只有一條鏈作為轉錄模板，合成單鏈RNA分子。啟動(dòng)子和終止子序列決定轉錄的起始和終止。
在E.coli中RNA多聚酶轉錄各種RNA（mRNA，tRNA和rRNA）。在真核細胞中有三類(lèi)不同的RNA多聚酶，它們的功能不同。RNA pol Ⅰ轉錄4種rRNA中的3種；RNA pol Ⅱ轉錄mRNA和一些snRNA；RNAⅢ轉錄第四種rRNA，tRNA以及其余的snRNA。
3種真核生物的RNA pol，不像E.coli RNA pol，沒(méi)有一個(gè)直接地和啟動(dòng)子區結合，而是通過(guò)轉錄起始因子的介導來(lái)起始RNA的合成。對于每一種RNA多聚酶來(lái)說(shuō)，轉錄因子是特異的，它可以識別啟動(dòng)子的特殊序列。
蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子位于轉錄起始位點(diǎn)的上游，由不同組合的啟動(dòng)原件所構成。特異的轉錄因子和調節因子結合在這些原件上，促進(jìn)RNA pol Ⅱ轉錄起始。增強子離啟動(dòng)子較遠，它可被調節因子識別結合，具有促進(jìn)基因轉錄的功能。
由RNA pol Ⅲ轉錄的啟動(dòng)子，位于下游，在其基因編碼序列內部。這種啟動(dòng)子，根據所轉錄的RNA的種類(lèi)，由不同的功能區組合而構成。轉錄因子識別這些功能區，促進(jìn)RNA聚合酶轉錄起始。
18S，5.8S和28S rRNA作為一個(gè)轉錄單位一道轉錄，產(chǎn)生前體RNA分子。大部分真核生物的18S，5-8S和28S rRNA都是以串聯(lián)重復排列，每個(gè)重復單位被不轉錄的間隔序列（nontranscribed specer,NTs）所分隔。轉錄單位的啟動(dòng)子位于NTS中，其功能是和特異的轉錄因子相結合，促進(jìn)RNA pol Ⅰ的轉錄起始。
中心法則的提出
從孟德?tīng)柖蓡?wèn)世以后，人們就知道了生物的各種性狀是由基因控制的。一基因一酶學(xué)說(shuō)的建立進(jìn)一步地明確了基因是以酶的形式通過(guò)控制生化反應鏈來(lái)控制的。酶或蛋白和基因又是什么樣的關(guān)系呢？也就是說(shuō)遺傳信息怎樣傳遞，怎樣表達成性狀呢？就在Watson和Crick建立DNA雙螺旋模型后的第三年，1957年Crick提出了中心法測（central dogma），指出了遺傳信息的傳遞方向：
DNA → RNA→蛋白質(zhì)
DNA RNA →蛋白質(zhì)
也就是說(shuō)由DNA通過(guò)轉錄將遺傳信息傳遞給RNA，RNA通過(guò)翻譯把信息傳遞給蛋白。通過(guò)這種單向的傳遞，遺傳信息通過(guò)蛋白質(zhì)的不同形式，如酶，結構蛋白，運載蛋白，調節蛋白等表達成一種性狀。
與轉運區別
區分mRNA和tRNA，可以從結構和功能這兩個(gè)方面去把握。
功能
⑴mRNA是合成蛋白質(zhì)的直接模板。每一種多肽鏈都有一種特定的mRNA做模板，因此細胞內mRNA的種類(lèi)也是很多的。它將DNA上的遺傳信息轉錄下來(lái)，攜帶到核糖體上，在那里以密碼的方式控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序，作為蛋白質(zhì)合成的直接模板。
⑵tRNA的功能是轉運氨基酸。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，tRNA與合成蛋白質(zhì)所需的單體——氨基酸形成復合物，將氨基酸轉運到核糖體中mRNA的特定位置上。
與反轉錄
簡(jiǎn)介
定義：以反義RNA為模版，通過(guò)反轉錄酶，進(jìn)行的RNA轉錄
信使RNA
2．反轉錄酶與反轉錄過(guò)程
反轉錄過(guò)程由反轉錄酶催化，該酶也稱(chēng)依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱(chēng)為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉錄酶存在于一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉化有關(guān)。人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有反轉錄酶，推測可能與細胞分化和胚胎發(fā)育有關(guān)。
生物學(xué)意義
反轉錄的發(fā)現有重要的理論意義和實(shí)踐意義。
1．對分子生物學(xué)的中心法則進(jìn)行了修正和補充，修正后的中心法則表示為：
可扼殺信使
microRNA雖然只有19－21個(gè)核苷長(cháng)度，但能夠通過(guò)綁定和中和負責蛋白翻譯的信使RNA，沉默大片段基因。迄今發(fā)現的microRNA已達到幾百種，它們在基因組中的調節作用日益引起人們關(guān)注。
最近，Wistar研究所的研究人員發(fā)現microRNA會(huì )經(jīng)歷一種生理學(xué)后果嚴重的分子編輯過(guò)程（molecular editing），序列的一個(gè)替換會(huì )改變這些microRNA的作用靶標，抑制非預期匹配物的表達，編輯過(guò)程出錯會(huì )導致嚴重的健康問(wèn)題。詳細內容刊登于2月23日《Science》雜志。
“我們發(fā)現，某些情況下已編輯的microRNA版本與未經(jīng)編輯的版本只有一個(gè)核苷差異，”文章高級作者、Wistar研究所基因表達和校準程序教授 Kazuko Nishikura博士說(shuō)，“這些已編輯的microRNA不是由DNA編碼的，意味著(zhù)至少兩個(gè)版本來(lái)自于同一個(gè)基因，這是未曾料到的……進(jìn)一步觀(guān)察，我們發(fā)現替換只出現在分子的特定關(guān)鍵區域，總共19或21個(gè)核苷長(cháng)度分子的第7或8位核苷，這兩個(gè)位點(diǎn)規定了靶標的特異性。提示替換可能會(huì )使已編輯的microRNA與未編輯的microRNA沉默完全不同的靶標。”
利用生物信息學(xué)工具將一種microRNA的已編輯版本和未編輯版本與已知的基因序列數據庫比對，研究人員鑒別出分別是兩種不同版本分子的靶標的兩組完全不同的基因，并從每組中分別挑選出三個(gè)基因，進(jìn)一步觀(guān)察microRNA是否會(huì )改變這些基因的表達效果。
接下來(lái)，研究人員隨機挑選出一個(gè)預期的靶標基因，探測microRNA的衍生物的潛能。所挑選的基因為PRPS1，其所編碼的酶在尿酸合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如果調節此酶不當，多種健康問(wèn)題會(huì )接踵而來(lái)。比如，表達量過(guò)高會(huì )引起血液中尿酸水平上升，引起風(fēng)濕痛；大腦中尿酸水平過(guò)高會(huì )損傷感覺(jué)神經(jīng)元，引起失聰。
在不能進(jìn)行RNA編輯（RNA editing）的轉基因小鼠和正常小鼠身上的實(shí)驗顯示，完全缺乏已編輯版本microRNA的小鼠，PRPS1酶水平是對照組的2倍，尿酸水平也是對照組的2倍。
Nishikura 說(shuō)這些證實(shí)，最初計算機所預測的同一基因編碼的未經(jīng)編輯的、已編輯的microRNA的不同靶標是正確的。至少對于PRPS1來(lái)說(shuō)是正確的，未經(jīng)編輯的和已編輯的microRNA的差異的生理學(xué)效果在尿酸水平的上升程度上顯示出來(lái)。
即便說(shuō)PRPS1基因是研究人員隨機挑選的，但研究結果提示一系列其它迄今原因未明的疾病很有可能是由新發(fā)現的microRNA編輯過(guò)程引起的。
提取分離純化
真核細胞的mRNA分子最顯著(zhù)的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A）尾巴。絕大多數哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞mRNA的3’端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA
試劑準備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2) 2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6）；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時(shí)，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6）；1mM EDTA(pH 8.0）；0.05% SDS 5．無(wú)水乙醇、70%乙醇 6．DEPC
操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無(wú)Poly(A）尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無(wú)吸收。7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置30min。9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時(shí)Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
應用
2020年12月，美國食品和藥物管理局(FDA)授權一款運用mRNA(信使核糖核酸)技術(shù)研制的新冠疫苗的緊急使用許可。
2022年2月，南非一公司3日對當地媒體表示，該公司利用已公開(kāi)的新冠疫苗核酸序列，開(kāi)發(fā)出非洲大陸首款mRNA（信使核糖核酸）新冠疫苗，計劃今年底前開(kāi)展臨床試驗。
南非當地時(shí)間2022年2月4日，據南非主流媒體報道，南非生物技術(shù)公司阿菲利根(Afrigen)日前已成功研制生產(chǎn)出非洲大陸首個(gè)mRNA新冠肺炎疫苗，該疫苗將于2022年11月正式投入臨床試驗。
2022年4月29日，斯微（上海）生物科技股份有限公司自主研發(fā)的新冠病毒mRNA疫苗已獲得國家藥監局批準，將開(kāi)展臨床試驗。
2022年9月，美國俄勒岡州立大學(xué)和俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)研究人員開(kāi)發(fā)出了首個(gè)用于治療卵巢癌以及惡病質(zhì)的信使核糖核酸（mRNA）療法。他們在實(shí)驗小鼠身上開(kāi)展了相關(guān)研究并取得了成功。
注意事項
1．整個(gè)實(shí)驗過(guò)程必須防止Rnase的污染。2．步驟⑷中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+）尾處的二級結構，使Poly(A+）尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會(huì )導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會(huì )阻礙柱內液體流動(dòng)，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。5．一般而言，107哺乳動(dòng)物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
參考資料
[1]
國際要聞回顧 · 中國科技網(wǎng)[引用日期2022-11-28]
[2]
第十七章 RNA的合成與加工 · 道客巴巴[引用日期2022-11-28]
[3]
用RTPCR對mRNA進(jìn)行定量分析 · 道客巴巴[引用日期2022-11-28]
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這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
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