反轉錄PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR),是指以mRNA為模板 在反轉錄酶作用下合成的cDNA 第一鏈的PCR。該反應分為兩步，第一步在單引物的介導和反轉錄酶的催化下合成RNA 的互補鏈cDNA; 第二步加熱后cDNA 與RNA 鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成雙鏈DNA,最后同常規PCR一樣，擴增靶DNA。合成cDNA 第一鏈所用的反轉錄酶是一類(lèi)依賴(lài)于RNA 的DNA 聚合酶。目前常用的反轉錄酶主要有兩種：一種是來(lái)源于禽成髓細胞性白血病病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)的AMV 反轉錄酶，另一種是來(lái)源于莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MoMLV) 的MOMLV 反轉錄酶。

反轉錄PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又稱(chēng)為逆轉錄PCR。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

中文名

反轉錄PCR

外文名

Reverse Transcription PCR，RT-PCR

別名

逆轉錄PCR

原理

提取組織或細胞中的總RNA

性質(zhì)

聚合酶鏈式反應廣泛應用的變形

概述

RT-PCR反應原理

RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。 RT- PCR即逆轉錄PCR，是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）相結合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

選擇

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。

4．MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長(cháng)cDNA。

合成

1． 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長(cháng)序列時(shí)，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(cháng)mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

操作

1. 總RNA的提取。

2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：如今試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。

（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列試劑的混合物：

10×PCR buffer 2μl

25mM MgCl2 2μl

10mM dNTPmix 1μl

0.1M DTT 2μl

輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加熱15min以終止反應。

（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：

第一鏈cDNA 2μl

上游引物（10pM） 2μl

下游引物（10pM） 2μl

dNTP(2mM) 4μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

（2）加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。

（3）設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時(shí)，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時(shí)擴增內參DNA，作為對照。

（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀(guān)察結果。

（5）密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

注意

1． 在實(shí)驗過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂。

2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

3． 內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． PCR不能進(jìn)入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長(cháng)度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關(guān)。故對于每一個(gè)目標序列出現平臺效應的循環(huán)數，均應通過(guò)單獨實(shí)驗來(lái)確定。

5． 防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶處理RNA樣品。

（2）在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線(xiàn)性。