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核酸內切酶
不具堿基特異性的酶
基本信息
| 中文名 | 核酸內切酶 |
| 外文名 | endonuclease |
| 類(lèi)型 | DNaseⅠ、DNaseⅡ |
| 性質(zhì) | 大都不具堿基特異性 |
簡(jiǎn)介
30多年前，當人們在對噬菌體（細菌病毒）的宿主特異性的限制-修飾現象進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現了限制性?xún)惹忻浮＜毦梢缘钟虏《镜娜肭郑@種"限制"病毒生存的辦法則可歸功于細胞內部可摧毀外源DNA的限制性?xún)惹忻浮Ｊ着话l(fā)現的限制性?xún)惹忻赴▉?lái)源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來(lái)源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNA，將基因切割成小的基因片段。
當限制性?xún)惹忻傅膽迷谏鲜兰o七十年代流傳開(kāi)來(lái)的時(shí)候，以NEB為代表的許多公司開(kāi)始尋找更多的限制性?xún)惹忻浮３四承┎《疽酝猓拗菩詢(xún)惹忻钢辉谠松镏斜话l(fā)現。人們正在從數以千計的細菌及古細菌中尋找新的限制性?xún)惹忻浮６鴮σ褱y序的原核基因組數據分析表明，限制性?xún)惹忻冈谠松镏衅毡榇嬖冢?a class="dict" href="/know/2806009/">自由生存的細菌和古細菌似乎都能編碼限制性?xún)惹忻浮?/span>
限制性?xún)惹忻傅闹饕δ苁潜Ｗo細菌不受噬菌體的感染，這一觀(guān)點(diǎn)已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機制的一部分行使其功能。當一個(gè)沒(méi)有限制性?xún)惹忻傅募毦?a class="dict" href="/azgame/nos397120.html">病毒感染時(shí)，大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個(gè)有限制性?xún)惹忻傅耐N細菌被成功感染的比率顯著(zhù)下降。出現更多的限制性?xún)惹忻笇?huì )起到多重保護作用；而一個(gè)擁有4到5種各自獨立的限制性?xún)惹忻笇?huì )使細胞堅不可摧。
上世紀80年代，科學(xué)家開(kāi)始克隆并表達限制性?xún)惹忻浮?/span>克隆技術(shù)由于將限制性?xún)惹忻傅谋磉_與原有細胞環(huán)境分離開(kāi)來(lái)，避免了原細胞中其它內切酶的污染，從而提高了酶的純度。此外，克隆技術(shù)提高了限制性?xún)惹忻傅漠a(chǎn)量，簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，使得生產(chǎn)成本顯著(zhù)降低；克隆的基因很容易進(jìn)行測序分析，表達出的蛋白也能進(jìn)行X射線(xiàn)結晶分析，這使得我們對于克隆產(chǎn)物更加確定。
限制酶圖
同一DNA用不同的限制酶進(jìn)行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點(diǎn)，由此建立的位點(diǎn)圖譜有助于對DNA的結構進(jìn)行分析。
限制性核酸內切酶分析技術(shù)是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結構和進(jìn)行流行病學(xué)研究的有效方法，對動(dòng)物檢疫有很重要的實(shí)用意義，尤其對區別進(jìn)出境動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來(lái)毒有很重要的意義。
作用及分類(lèi)
限制性核酸內切酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)限制性酶)是一類(lèi)識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以?xún)惹蟹绞剿釪NA，產(chǎn)生5’-P和3’-OH末端。 1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時(shí)發(fā)現了宿主控制性現象。Arber及其同事用放射性同位素標記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，據此他們提出了限制 - 修飾酶假說(shuō)。對于一個(gè)宿主細胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其細胞中的一對酶，它們對DNA底物有相同的識別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內部拆卸水解，甲基化酶是修飾，DNA分子經(jīng)修飾后，就可逃避限制性酶的識別，而甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。
限制性酶主要分為三種類(lèi)型：Ⅰ型限制酶為復合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在 DNA鏈上沒(méi)有固定的切割位點(diǎn)，一般在離切割位點(diǎn)1kb到幾kb的地方隨機切割，不產(chǎn)生特異性片段。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特異性的切割位點(diǎn)，但這兩類(lèi)酶對 DNA酶切分析的意義不大，通常所說(shuō)的限制性?xún)惹忻甘侵涪蛐兔福軌蜃R別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸順序，產(chǎn)生特異性的DNA片段。
2.識別序列及消化產(chǎn)物的末端結構 限制性酶的識別序列，大部分具有雙軸對稱(chēng)性結構或稱(chēng)回文序列，如EcoRI的識別序列為：
GAA
TTC
橫軸
CTT
AAG
縱軸
將縱軸一側的序列以橫軸為中心旋轉180°，則縱軸兩側的序列相互對稱(chēng)，這種結構又稱(chēng)為雙重對稱(chēng)結構。大部分酶的識別序列長(cháng)度為4-6個(gè)核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現頻率高，對一隨機排列的DNA分子來(lái)說(shuō)，理論值為1/44，因此4核苷酸識別序列的限制性酶在DNA鏈上切點(diǎn)多，產(chǎn)生片段的數目多，長(cháng)度短，顯示出酶的特異性較低。對于5和6核苷酸識別序列的酶，出現頻率分別為1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出現頻率低，酶的特異性強，而8核苷酸識別位點(diǎn)在DNA鏈中出現機率更低(1/48 )，特導性更強，可提供更長(cháng)的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對稱(chēng)性序列，其回文識別序列被個(gè)或幾個(gè)其他核苷酸所間隔，如BglⅠ，這種酶的特異性比識別長(cháng)度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(約10種，如BbVⅠ等)，其識別序列不表現為回文結構，它們降解雙鏈DNA時(shí)，酶切點(diǎn)大部分不在識別序列內，而是與識別序列相距5至13個(gè)核苷酸殘基不等。
限制性酶切片段的末端結構：限制性酶不但有特定的識別序列，并且任何一種酶切割 DNA鏈時(shí)，總是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5’端帶磷酸單酯基團，而3’末端則為游離羥基。因此某一種酶的全部產(chǎn)物的末端具有相同的結構。根據切點(diǎn)序列的結構特點(diǎn)，產(chǎn)物的末端可分為粘性末端和平末端兩類(lèi)。粘性末端指酶切后DNA片段末端帶有1-4個(gè)核苷酸殘基的單鏈結構，而片段兩端突出的單鏈具有互補性，突出的單鏈因部位的不同，又可分為5’-與3’-粘性末端兩種，突出的單鏈帶5’磷酸單酯的稱(chēng)5’-粘性末端，而突出的單鏈含3’-羥基則稱(chēng)3’-粘性末端。平末端指酶切后，片段為齊頭末端結構。在DNA體外重組時(shí)，粘性末端是DNA連接酶的有效底物，有很高的連接效率。
影響及因素
限制性酶切反應速度與底物的性質(zhì)有很大的關(guān)系，底物的單雙鏈結構、分子的構型、DNA鏈中酶識別位點(diǎn)的數目以及位點(diǎn)附近的序列等都影響著(zhù)酶的催化反應。共價(jià)閉合環(huán)(超螺旋構型)DNA比其相應的線(xiàn)性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構型DNA徹底降解，需要的酶量就大。對于DNA-RNA雜合雙鏈的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8種酶切時(shí)，結果其 DNA鏈可被切割，但酶用量比雙鏈DNA大20-50倍。部分限制性酶還可切割單鏈DNA，如 Hae Ⅲ等。
每一種限制性酶都有自身的識別特異性，在通常酶反應條件下，特異性不會(huì )改變，但在特殊條件下，某些酶的特異性會(huì )隨之改變，如當反應緩沖液的pH由7.5升高至8.5，或甘油濃度超過(guò)5%，或用Mn艸代替Mg艸時(shí)EcoRI的識別序列由原來(lái)的GAATTC變?yōu)锳ATT，結果是DNA鏈上切點(diǎn)數量增加，產(chǎn)物片段變小，因此在不合適的反應條件下，限制性酶可表現與原來(lái)特異性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要確保酶解條件，注意底物DNA的純度，盡可能防止酶的第二活性。
反應液中鹽的濃度是至關(guān)重要的，因此要根據所使用的酶來(lái)確定鹽的濃度。限制性酶對鎂離子的要求并不嚴格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般為每微克DNA 1-5單位，為保險起見(jiàn)以過(guò)量3-5倍為宜，但最好先作預實(shí)驗。
從理論上講，延長(cháng)反應時(shí)間可以節省酶，但長(cháng)時(shí)間消化受酶的穩定性、雜酶的影響等因素的制約。國產(chǎn)酶不宜超過(guò)1.5小時(shí)，其他酶一般也以1-2小時(shí)為宜。酶切反應的溫度一般在 37℃，只有少數酶要求特殊反應溫度，如TaqⅠ要求65℃。低于37℃時(shí)大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。許多酶可用熱處理(65℃)10-15分鐘使酶反應終止，但并非所有酶都能熱終止，不能熱終止的酶可用過(guò)量EDTA終止或用酚提取來(lái)終止。
操作及應用
1.操作步驟 以動(dòng)物病毒為例說(shuō)明酶切反應步驟。
(1) 病毒DNA的提取和純化 當繁殖病毒的細胞出現80%-100%的細胞病變時(shí)(CPE)，收獲并凍融三次使細胞破裂釋放出病毒，3 000r/min離心10分鐘，吸出上清，加10% SDS至終濃度為1%，于56℃水浴作用30分鐘，加等體積的飽和酚，混勻10 000r/min離心10-15分鐘，取上清反復抽提至界面無(wú)蛋白質(zhì)為止，取上清用乙醚去酚數次，真空除去乙醚，然后加2.5倍預冷無(wú)水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min離心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗滌兩次，pH8.0 TE緩沖液溶解，取少量用紫外分光光度計測其含量和純度，其余置－20℃貯存備用。
(2) 酶切反應 將病毒DNA用TE溶解為大約0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切緩沖液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用滅菌雙蒸水補足至50μl，在振蕩器上溫和振蕩幾秒鐘，然后稍稍離心(3 000r/mmin)數秒，以使管壁液體集中于管底，37℃恒溫水浴中孵育1小時(shí)，65℃水浴作用10分鐘，或用EDTA終止反應。
(3) 電泳 依據酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠作為支持物進(jìn)行電泳，同時(shí)加入標準DNA作分子量參照物，經(jīng)溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應的光源下觀(guān)察結果并拍攝記錄電泳圖譜。
以上為酶切反應操作的基本過(guò)程。如果進(jìn)行多酶切反應，則要考慮反應緩沖液要基本適用于所用的各種酶。若兩種以上的酶對緩沖液要求不同，如鹽濃度要求不同時(shí)，先進(jìn)行低鹽要求的酶切反應，再進(jìn)行高鹽要求的反應，對反應溫度要求不一的也是先進(jìn)行低溫度酶切，再進(jìn)行高溫度酶切。
2.酶切分析應用 限制性核酸內切酶在分子生物學(xué)研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個(gè)研究領(lǐng)域都離不開(kāi)限制性?xún)惹忻福鋺梅浅V泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重組和組建新質(zhì)粒；建立DNA的物理圖譜等。
用限制性?xún)惹忻阜治?Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成為一種常用的方法，通過(guò)酶切消化DNA，然后電泳染色呈現大小不一的片段，對這些片段的遷移率及數量進(jìn)行分析，便可了解到病原微生物遺傳物質(zhì)的一定特性，在此基礎上采用雙酶切割或雜交等方法，則可推測出片段的排列順序和酶切位點(diǎn)，從而推斷出DNA間存在的相似性或差異性，對于動(dòng)物病毒尤其是對疫苗毒、野毒及變異毒株的檢測具有重要的意義。
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