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DNA連接酶
生物學術語之一
基本信息
| 中文名 | DNA連接酶 |
| 外文名 | DNA Ligase |
| 別名 | DNA黏合酶 |
| 類型 | 生物學術語 |
| 作用 | 連接DNA鏈3‘-OH末端 |
| 條件 | 需要消耗ATP |
| 原理 | 催化作用 |
收起
簡介
DNA連接酶
發(fā)現(xiàn)
性質
大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75Ku的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數(shù)相近，這也是比較合理的現(xiàn)象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。
噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。
用途
分類
T4DNA連接酶
T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5′磷酸基和3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。可接雙鏈DNA的平末端、相容黏末端及其中的單鏈切口，在分子生物學中有廣泛的應用。T4DNA連接酶是經(jīng)原核表達，柱層析純化獲得的高純T4DNA接酶，SDS-PAGE顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用于DNA片斷接、克隆等各種反應。
內(nèi)容與儲存方法
名稱:T4DNALigase數(shù)量:20ml 保存條件:-20℃
DNA連接
10×LigationBuffer成分：
Tris-HClpH7.8600mM
MgCl215mM
DTT100mM
ATP10mM
連接條件
推薦在10~20ml反應體系中進行接反應，反應中DNA濃度最大可達1mM（1kbDNA約1mg/ml）。首先混合要接的DNA片段，加入10×LigationBuffer至終濃度為1×，再加入適量T4DNALigase混勻。最適連接溫度為16℃。粘末端連接效率較高，加入0.2~1mlT4DNALigase,可在室溫或16℃反應1~3小時完成反應；平末端連接效率較低，加入1mlT4DNALigase，通常需要在16℃或4℃過夜完成反應。
注意事項
1)10xLigationBuffer含有ATP，使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。
2)T4DNALigase對熱敏感，容易失活。使用時請放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。
3)如需在接反應后滅活T4DNALigase，可于65℃孵育10min即可。
熱穩(wěn)定DNA連接酶
功能
限制性核酸內(nèi)切酶（以下簡稱限制酶）：限制酶主要存在于微生物（細菌、霉菌等）中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術刀”）。發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如，從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，就能被某種限制酶切割下來。在基因工程中起作用。
DNA連接
反轉錄酶：RNA指導的DNA聚合酶，具有三種酶活性，即RNA指導的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術中，作為重要的工具酶被廣泛用于建立基因文庫、獲得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
解旋酶：是一類解開氫鍵的酶，由水解ATP來供給能量它們常常依賴于單鏈的存在，并能識別復制叉的單鏈結構。在細菌中類似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移動方向是5'→3'，但也有3'→5'移到的情況，如n'蛋白在φχ174以正鏈為模板合成復制形的過程中，就是按3'→5'移動。在DNA復制中起做用。
DNA限制酶作用于磷酸二酯鍵
DNA連接酶作用于磷酸二酯鍵
DNA聚合酶作用于磷酸二酯鍵
DNA解旋酶作用于氫鍵
連接手段
目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：
第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；
第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。
粘性末端DNA片段的連接
DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。
平末端DNA片段的連接
同聚物加尾法
這種方法的核心部分是，利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能。末端脫氧核苷酸轉移酶是從動物組織中分離出來的一種異常的DNA聚合酶，它能夠將核苷酸（通過脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3′-OH基團上。由核酸外切酶處理過的DNA，以及dATP和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中，DNA分子的3′-OH末端將會出現(xiàn)單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段，稱之為poly（dA）尾巴（圖2-7）。反過來，如果在反應混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端將會形成poly（dT）尾巴。因此任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就會彼此連接起來。這種連接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴連接法（homopolymertail-joining），簡稱同聚物加尾法。
銜接物連接法
所謂銜接物（linker），是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。銜接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補的粘性末端。于是我們便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。
DNA接頭連接法
DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。實際使用時對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造，可避免處在同一反應體系中的各個DNA接頭分子的粘性末端之間發(fā)生彼此間的配對連接。
DNA聚合酶
也稱耐高溫DNA聚合酶。
1988年，Saiki從嗜熱水生真菌Thermus aquatics YT-1株中分離得到，該菌株于1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離出。
特性
良好的熱穩(wěn)定性；
70℃ 2h，殘留90%活性；
93℃ 2h，殘留60%活性；
94℃ 2h，殘留40%活性。
5’→3’聚合酶活性，對dATP有優(yōu)先聚合活性；
5’→3’外切酶活性；
無3’→5’外切酶活性。
用途
缺點
措施：選擇高保真Taq酶，如Pfu。
原因：Pfu具有3’→5’外切酶活性。
注意：Pfu擴增產(chǎn)物為平末端。
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