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抗原修復(fù)
組織在制作過程中，由于化學(xué)試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來，為了解決上述的問題，利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來或修正過來的過程稱為抗原修復(fù)。
基本信息
| 中文名 | 抗原修復(fù) |
| 所屬領(lǐng)域 | 化學(xué)生物學(xué) |
基本信息
在免疫組化染色后的鏡下觀察中，有發(fā)現(xiàn)這樣的結(jié)果，陽性物反應(yīng)不強(qiáng)，時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，表達(dá)不均勻，有時(shí)可出現(xiàn)假陰性，這是因?yàn)椋?/span>
1.組織在用甲醛固定的過程中所形成的醛鍵可封閉抗原的決定簇。甲醛與組織蛋白質(zhì)類的反應(yīng)是多樣而復(fù)雜的，因?yàn)樗芎投喾N不同的功能基團(tuán)結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵8。這也是甲醛的一個(gè)作用，因?yàn)樗且环N聚合固定劑，因而能在相鄰的蛋白質(zhì)鍵間形成橋鍵的作用。
2. 甲醛在保存進(jìn)程中會(huì)形成羥甲基，也可封閉抗原決定簇。據(jù)French和Edsall的研究認(rèn)為，最常遇到的甲醇反應(yīng)，就是加到一個(gè)含反應(yīng)性氫原子的化合物中，形成一個(gè)羥甲基化合物。
為了解決上述存在的問題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來，目前世界上公認(rèn)的方法就是必須進(jìn)行抗原修復(fù)。
至今為止，抗原修復(fù)有許多種方法，在這些方法中，有的是根據(jù)抗體的要求來進(jìn)行，有的是根據(jù)抗原的表達(dá)程度來進(jìn)行，我們則對(duì)每種病例每項(xiàng)檢測(cè)，都要求必須進(jìn)行抗原修復(fù)，以達(dá)到抗原全面表達(dá)的最佳狀態(tài)。
物理化學(xué)試劑抗原修復(fù)法
1. 真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：
① 切片脫蠟至水。
③自來水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
這是一種操作簡(jiǎn)單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點(diǎn)有四：一是各物質(zhì)的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機(jī)會(huì)；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發(fā)生變性，又不需要使抗原修復(fù)液達(dá)到沸騰，不會(huì)導(dǎo)致切片因抗原修復(fù)液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復(fù)制片的麻煩，保證了病理報(bào)告的及時(shí)發(fā)生，為病人爭(zhēng)取更多的時(shí)間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進(jìn)行操作；四是可以一次性制作大批的切片。
2.微波輻射抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測(cè)Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。
⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色。
該法與上法相比，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生瞬間熱。當(dāng)然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達(dá)到目的。應(yīng)用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質(zhì)分子作極性運(yùn)動(dòng)。促進(jìn)形成的醛鍵斷裂開。分子間運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬間熱，當(dāng)達(dá)到有效的溫度后，就可導(dǎo)致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點(diǎn)是：產(chǎn)熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復(fù)液的沸騰，使用微波爐時(shí)禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。
3.高壓抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。
該法高壓和高熱來促進(jìn)醛鍵的斷裂，當(dāng)加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時(shí)的溫度已達(dá)121℃左右。該法被應(yīng)用于一些較難修復(fù)的抗原，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，該法效果不錯(cuò)。
4.隔水熱抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計(jì)測(cè)其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后（92℃↑）。即開始計(jì)時(shí)，持續(xù)40分鐘。
⑤待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
該法應(yīng)用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長時(shí)間的熱的作用，在早期應(yīng)用于Er和Pr染色的抗原修復(fù)時(shí)，我們的修復(fù)時(shí)間為40分鐘，如果達(dá)不到這時(shí)間，效果將不理想。
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
④ 將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。
⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
對(duì)各種抗原修復(fù)方法的評(píng)價(jià)。
該法是在沒有上述的設(shè)備時(shí)才選用的一種方法，當(dāng)然效果是最差的，因?yàn)樗皇菃慰繜岬淖饔茫@是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計(jì)來測(cè)量溫度，對(duì)其溫度不好控制，有時(shí)需要多次關(guān)閉電源來維持所需的溫度。
抗原修復(fù)，必須注意以下問題
1、PH值的應(yīng)用范圍及選擇。
應(yīng)用于抗原修復(fù)的物質(zhì)很多，但至今為止，大家公認(rèn)的最好的抗原修復(fù)液還是檸檬酸鹽緩沖液PH6.0，據(jù)多年來的實(shí)踐認(rèn)為，該液確實(shí)很好，它適合于大多數(shù)的抗原，在常規(guī)應(yīng)用的臨床標(biāo)記抗體中基本都適用，經(jīng)用該液修復(fù)后的抗原表達(dá)增強(qiáng)，抗原的定性和定位很理想，結(jié)果不錯(cuò)。但近來也有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用抗原修復(fù)液PH8.0的效果也不錯(cuò)。
2.抗原修復(fù)時(shí)應(yīng)選擇最佳溫度。
據(jù)Masson等研究表明：70℃－90℃的溫度對(duì)沒有經(jīng)固定的蛋白可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白，要使其發(fā)生變性，溫度必須在92℃↑。據(jù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因?yàn)椋孩龠@種溫度未達(dá)沸騰，切片不容易脫離裁片；②能夠解離和破壞與蛋白交聯(lián)的甲醛醛鍵等，處理時(shí)可以隨意選擇和確定抗原修復(fù)的作用時(shí)間。
3.抗原修復(fù)時(shí)有效溫度所需持續(xù)時(shí)間根據(jù)各單位的設(shè)備條件以及使用的儀器不同，抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間也不一樣。例如：真空負(fù)壓抗原修復(fù)法，當(dāng)達(dá)到預(yù)定的溫度和所需的負(fù)壓（66.7KPa）后可持續(xù)5-10分鐘，微波輻射抗原修復(fù)法溫度不好控制，抗原修復(fù)液容易沸騰，如果切片附貼任憑其沸騰持續(xù)5-10分鐘。如果切片附貼很牢固，為了防止脫片，一發(fā)現(xiàn)抗原液已沸騰，即可關(guān)掉電源，待溫度下降后，又可重開電源。如此反復(fù)數(shù)次，使之持續(xù)10分鐘。不過似這種停停開開著的做法效果不如開著的，因?yàn)殚_著的除了熱效應(yīng)以外，還有足量的微波輻射。應(yīng)用高壓抗原修復(fù)法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗原修復(fù)液沸騰后，加上壓力閥，出現(xiàn)噴氣后，可持續(xù)時(shí)間達(dá)2-4分鐘。隔水熱加熱抗原修復(fù)法，要特別注意內(nèi)外液體的溫度，內(nèi)液指抗原修復(fù)液，外指浸泡抗原修復(fù)液容器的水，應(yīng)用時(shí)用溫度計(jì)浸入抗原修復(fù)液測(cè)試，使之保持在有效的溫度（92℃↑）范圍內(nèi)。持續(xù)時(shí)間在40分鐘，電爐加熱抗原修復(fù)法，其持續(xù)時(shí)間在10分鐘以上。由于效果較差，該法目前較少使用。
4.抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的。
抗原修復(fù)持續(xù)時(shí)間過后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，決不能為了爭(zhēng)取時(shí)間，強(qiáng)行用冰塊或冷水令其降溫。這是因?yàn)楫?dāng)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個(gè)自然環(huán)境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會(huì)慢慢地恢復(fù)原來的形態(tài)和構(gòu)型。如果用冰塊和冷水強(qiáng)行令其降溫，松開后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來，恢復(fù)不了原有的構(gòu)型，達(dá)不到預(yù)想的效果。
5.盡量使用足量的抗原修復(fù)液。
抗原修復(fù)的方法，都采用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由于產(chǎn)熱快。液體容易揮發(fā)直至干涸。因此，應(yīng)用于抗原修復(fù)的液體，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修復(fù)的切片，如果由于液體少而導(dǎo)致切片的干涸，則應(yīng)丟棄切片，因?yàn)闊岣珊缘那衅械目乖菦]辦法補(bǔ)救的，因它是一種不可逆的現(xiàn)象。據(jù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，用于微波輻射抗原修復(fù)的液體，量大可多至1000ml。應(yīng)用大量的抗原修復(fù)液時(shí)，由于它的量較大，可延緩了液體的沸騰時(shí)間，增加了切片受微波輻射的量，對(duì)抗原修復(fù)將達(dá)到徹底。
6.切片必須附貼牢固。
用于抗原修復(fù)的切片，必須附貼牢固，否則發(fā)生掉片，則前功盡棄。
化學(xué)試劑抗原修復(fù)法
1. 胃蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS沖洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色。
2.胰蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
評(píng)價(jià)：上面介紹了胃蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶的使用方法，因這兩種酶在平常較常被使用，故而專門進(jìn)行介紹，除此之外，無有幾種酶如鏈霉蛋白酶，無花果蛋白酶菠蘿蛋白酶等也可被用來消化切片。其用法基本一樣。
現(xiàn)今應(yīng)用酶來消化切片，主要是根據(jù)抗體的要求來進(jìn)行的，否則都應(yīng)用物理化學(xué)試劑抗原修復(fù)法來進(jìn)行。因?yàn)槊赶贿m合于多數(shù)的抗體，效果也沒有其它方法好，因此臨床上都較少用它。
作好免疫組化染色必須注意的問題
I、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化最后結(jié)果的判斷時(shí)，?？梢姷骄鶆蛞黄乃品翘禺愋匀旧默F(xiàn)象，經(jīng)多方研究認(rèn)為，它是一種假性非特異性的染色。因?yàn)槟[瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴(kuò)散彌散，腫瘤細(xì)胞無限制的生長和生長過速，導(dǎo)致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用，可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì)，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時(shí)的固定所引起的。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會(huì)自溶，抗原就會(huì)擴(kuò)散，這是一非常普通的常識(shí)，但要做好卻是極不容易。標(biāo)本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時(shí)間，在這段時(shí)間里，有的抗原就可以發(fā)生擴(kuò)散。雖然已浸入了固定液，但標(biāo)本較大，固定液的量又不足，當(dāng)然由于固定液的滲透需要時(shí)間，當(dāng)滲入到組織之中時(shí)，中間的細(xì)胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴(kuò)散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當(dāng)切除后標(biāo)本較大，雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達(dá)到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，當(dāng)固定液發(fā)揮作用時(shí)，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達(dá)到免疫組織化學(xué)染色的要求，對(duì)于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應(yīng)將其剖開，早取材，早固定。
II、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時(shí)間內(nèi)脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導(dǎo)致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復(fù)操作，造成人力物力的浪費(fèi)，造成病理報(bào)告的延期發(fā)出等。因此，對(duì)取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外，即平整、外觀好看，還要求適中。
III、切片必須完整、均勻、平展、無皺折、
應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的切片，對(duì)切片的質(zhì)量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí)，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引起混淆。
免疫組織化學(xué)染色前的前期準(zhǔn)備工作，就是必須對(duì)新的載玻片進(jìn)行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認(rèn)為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯(cuò)誤的想法。新出廠的載玻片，表面復(fù)蓋著開一層油脂樣的物質(zhì)，如果不加以處理，對(duì)切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí)甚至過夜，然后取出，經(jīng)自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達(dá)2小時(shí)以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無水乙醇洗2次，烘干即可使用。
V、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應(yīng)用于免疫組化染色的切片。由于整個(gè)過程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理，如抗原修復(fù)時(shí)抗原修復(fù)液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復(fù)沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達(dá)十幾小時(shí)。因此，對(duì)切片的質(zhì)量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進(jìn)行結(jié)果是切片掉片嚴(yán)重，切片松動(dòng)率占100%。切片究竟烘烤多長時(shí)間才合適，既不脫片和適合各項(xiàng)要求，又不至于破壞抗原。幾組實(shí)驗(yàn)[]診斷P173認(rèn)為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時(shí)最為合適。這是因?yàn)椋嚎乖赡褪苋绱说臏囟?，病理科一般使用?/span>石蠟，其熔點(diǎn)在60℃左右，組織浸蠟時(shí)，浸蠟箱中的溫度，一般都調(diào)在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時(shí)以上，才能達(dá)到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗(yàn)，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時(shí)間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達(dá)100%，保證了病理診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。
特需要注意的是，不管是應(yīng)用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應(yīng)盡快進(jìn)行染色。如果切片切完后，遲遲不進(jìn)行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會(huì)隨著時(shí)間的延長而逐漸消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達(dá)更多的抗原。
VI、切片脫蠟必須干凈，否則將會(huì)影響免疫組化染色的最后結(jié)果。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時(shí)間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮程度采用不同脫蠟時(shí)間。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長，10-20分鐘或更長?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果也會(huì)更好。
VII、必須徹底抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過氧化物酶，尤其在紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細(xì)胞和組織如果在染色前不對(duì)其進(jìn)行處理和抑制，它們將會(huì)在DAB底物的顯色時(shí)，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行抑制。當(dāng)然，對(duì)它們進(jìn)行徹底的消除是不行的，因?yàn)橐种铺珔柡Γ瑢?duì)抗原也會(huì)有相同的抑制作用。氫在抑制內(nèi)源性過氧化物酶時(shí)，也要注意對(duì)抗原的保護(hù)，抑制也只能針對(duì)它們中的大部分，在DAB顯色后，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽性物區(qū)別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因?yàn)槭惺鄣腍2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關(guān)于H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為H2O2甲醇較適合于大多數(shù)的情況，因?yàn)槌薍2O2外，甲醇對(duì)各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認(rèn)為在多數(shù)情況中，用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿意的結(jié)果。
VIII、須適當(dāng)合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動(dòng)物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認(rèn)為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分無特異性地結(jié)合（如膠原）。由于這種非特異性結(jié)合，將導(dǎo)致標(biāo)記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標(biāo)記的抗體無特異性結(jié)合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對(duì)作適當(dāng)?shù)谋４婧团渲啤?/span>
VVI、選擇合適的抗體
至今為止，應(yīng)用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當(dāng)中又可分為兩種類型。
濃縮型抗體
根據(jù)近幾年來使用的情況認(rèn)為，它有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處：
①可作為各種疾病檢測(cè)的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時(shí)很長時(shí)間才遇到一例，這就給抗體的應(yīng)用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時(shí)購買，則需較長的時(shí)間，這樣就會(huì)延誤診斷。實(shí)踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測(cè)抗體。當(dāng)購買抗體后，根據(jù)檢測(cè)病例的數(shù)量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟?zāi)し馄饋?，于?0℃的低溫冰箱中保存，臨用時(shí)取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。
②成本低，價(jià)格較便宜。
它與即用型的抗體相比較，價(jià)格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價(jià)格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計(jì)，可標(biāo)記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價(jià)格150元，可標(biāo)記30例，每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復(fù)雜。
對(duì)于新購入的濃縮型的抗體，使用時(shí)必須將稀釋為工作液，才能使用，對(duì)于從未用過的抗體，還必須實(shí)驗(yàn)其實(shí)際的稀釋度，因?yàn)楦鞣N抗體，廠家都做了相應(yīng)的稀釋度的實(shí)驗(yàn)，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對(duì)抗體的稀釋度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結(jié)果在1：50上是最佳結(jié)果，這就是最佳的稀釋點(diǎn)，如果在這范圍內(nèi)找不出最佳稀釋點(diǎn)，則應(yīng)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)直到找出最佳稀釋點(diǎn)為止。
④需要配置各型號(hào)的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。
即用型抗體
近幾年來，免疫組化技術(shù)應(yīng)用的推廣，即用型抗體的應(yīng)用越來越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來的使用，認(rèn)為它有許多優(yōu)點(diǎn)和不足：
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器?，F(xiàn)今的微量加樣器，如為進(jìn)口貨，貴者多達(dá)兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋，即買即用，無需配備其余器械。
④特別適合于基層單位?；鶎訂挝唬瑹o需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對(duì)于提高診斷的準(zhǔn)確率，極有好處。
⑤價(jià)格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對(duì)于3ml一個(gè)包裝的抗體，一年需要用幾支，這對(duì)抗體來說，不會(huì)造成浪費(fèi)。但如果為較小的單位，一年中標(biāo)記的病例較少，購買抗體時(shí)也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見的病例，有時(shí)一年也標(biāo)記不了幾例，這樣就應(yīng)采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年，因?yàn)榭贵w從生產(chǎn)商到銷售商的手里，需要一定的時(shí)間，如果運(yùn)氣好的話，你購買到的抗體，是剛交到銷售商的手里，那么，使用的時(shí)間可能長些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時(shí)間，抗體的有效使用期就可能不會(huì)太長，五個(gè)月、六個(gè)月或者三個(gè)月。如果在有效的時(shí)間內(nèi)不能使用完。稍為超過一些時(shí)間還可以，如果時(shí)間過長，就應(yīng)當(dāng)丟棄，因?yàn)闀?huì)影響標(biāo)記的質(zhì)量。有人抱怨，剛買的抗體標(biāo)記很好，后來就漸漸不好了。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，抗體的活性會(huì)逐漸失去生物活性，導(dǎo)致了標(biāo)記質(zhì)量的下降。
抗體的適應(yīng)癥
在眾多的抗體中，按它們的實(shí)際使用范圍，把它們分為兩個(gè)類：
1. 適合于冰凍切片，涂片，細(xì)胞培養(yǎng)片。
2. 適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細(xì)胞培養(yǎng)片。
選擇合適的單克隆或多克隆抗體
抗體除了分為上述的兩個(gè)類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。
1.單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當(dāng)中，大部分都是單克隆抗體。這要?dú)w功于生物技術(shù)的不斷提高。在早些時(shí)候，應(yīng)用于臨床的抗體，大多數(shù)為多克隆抗體。
2. 多克隆抗體，在臨床應(yīng)用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。
抗體的加入
這看似很簡(jiǎn)單的問題，如果處理不好也可導(dǎo)致不同的結(jié)果，如果應(yīng)用自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問題：
1. 當(dāng)PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上PBS存留過多，將會(huì)稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時(shí)也將影響最后的結(jié)果，如假陰性等。
2. 加入的抗體以一滴為佳。
當(dāng)擦干組織塊周邊多余的PBS后，切片保持著一定的濕潤度，此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候，滴入抗體以一滴50μl為好，加入后，輕微地?fù)u勻地覆蓋于切片上，使最后的結(jié)果穩(wěn)定均衡，不至于有的地方有反應(yīng)，有的地方無反應(yīng)。
3. 切片沒擦好將會(huì)影響加入抗體的質(zhì)量，切片沒沖洗干凈，沒擦試好，當(dāng)加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時(shí)你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個(gè)切片，便會(huì)使勁地加入抗體，此時(shí)的結(jié)果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒達(dá)到目的，還浪費(fèi)抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
選擇合適的孵育時(shí)間
第一抗體的孵育時(shí)間，有較多的使用范圍，應(yīng)用于臨床檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對(duì)于研究性質(zhì)的抗體孵育時(shí)間，也可按照上述的時(shí)間，但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)一般不主張于4℃冰箱中過夜，原因是：
1.長時(shí)間的孵育可以使一些非特異性的物質(zhì)沉淀下來，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強(qiáng)，不需要長時(shí)間的孵育，也能夠結(jié)合得很好。
3.長時(shí)間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長時(shí)間的孵育，不利于臨床病理報(bào)告的發(fā)出。
X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時(shí)就必須要仔細(xì)地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進(jìn)行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應(yīng)的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔(dān)心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號(hào)，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時(shí)間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進(jìn)行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進(jìn)行。
XI、復(fù)合物的使用及孵育時(shí)間的確定。
各種方法有各自的復(fù)合物，如ABC法，復(fù)合物是卵白素和生物素結(jié)合的復(fù)合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復(fù)合物是鏈雪菌素蛋白復(fù)合物，再帶有HRP，EV二步法的復(fù)合物則是二抗和三抗連接在一起的復(fù)合物，再帶上HRP，除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
XII、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導(dǎo)致最后結(jié)果的關(guān)鍵。
1.單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對(duì)準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。
3.沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱堿性條件（PH7－8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。下面將介紹有關(guān)方面的內(nèi)容：
緩沖液的配制
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個(gè)具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：
①在配制時(shí)，要先確定NaH2PO4的用量，因?yàn)樵撛噭┯性S多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如Na H2PO4含單個(gè)水分子時(shí)，配制時(shí)要稱取13.80g，而當(dāng)含有2個(gè)水分子時(shí)，則需要稱取15.60g。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過，以防污染，導(dǎo)致溶液中有雪菌生長。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
注意事項(xiàng)
①該試劑也應(yīng)注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現(xiàn)結(jié)晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結(jié)晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個(gè)，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
①PH測(cè)試筆測(cè)試，這是一種簡(jiǎn)便、易行、結(jié)果較為準(zhǔn)確的測(cè)試方法。當(dāng)配制完P(guān)BS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測(cè)試筆，打開開關(guān)，小屏幕上將可出現(xiàn)測(cè)出的PH結(jié)果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調(diào)校，大量的可用氫氧化鈉調(diào)校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調(diào)校，大量的可用HCL來調(diào)校。
②用試紙來測(cè)試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時(shí)，測(cè)試時(shí)在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測(cè)試PH值，?？科浞磻?yīng)的顏色來確定，十分簡(jiǎn)便，一般的試劑都可用它來測(cè)試。
③儀器測(cè)試：對(duì)于要求較高，需較準(zhǔn)確的PH值，須彩用儀器測(cè)試。
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水?dāng)嚢?，直至溶解，再加?N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時(shí)，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
配置HCL溶液注意事項(xiàng)：
①配制1N HCL時(shí)，如果大量配制，HCL入水時(shí)可產(chǎn)生很大的熱量，對(duì)的所用的玻璃器皿應(yīng)特別小心，以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調(diào)校PH值時(shí)，可參考上述的三種方法。
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