百科首頁(yè) > 正文

分子克隆（分子克隆）

次瀏覽 | 更新時(shí)間：2023-05-19

來(lái)源：網(wǎng)絡(luò )整理

精選百科

本文由作者推薦

分子克隆

在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過(guò)轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

基本信息

中文名	分子克隆
外文名	Molecular Cloning
方法	DNA分離
影響	在醫學(xué)、農業(yè)等方面有巨大作用
主題	DNA
引入寄主細胞	轉化或轉染、轉導
分類(lèi)	生物科技

收起

摘要

分子克隆

克隆(clone,clon)一詞源于希臘文Klon，原意為樹(shù)木的枝條。在生物學(xué)中其名詞含義系指一個(gè)細胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細胞或一群個(gè)體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱(chēng)無(wú)性繁殖(細胞)系；其動(dòng)詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中，即分子克隆技術(shù)。研究基因的第一步是分離它并獲得許多與它完全相同的拷貝。這稱(chēng)為“克隆”基因。一個(gè)基因被克隆的過(guò)程稱(chēng)為分子克隆。

分子克隆是指分離一個(gè)已知DNA序列，并以 in vivo（活體內）方式獲得許多復制品的過(guò)程。這一復制過(guò)程經(jīng)常被用于增加并獲取DNA片段中的基因，但也可用來(lái)增加某些任意的DNA序列，如啟動(dòng)子、非編碼序列、化學(xué)合成的寡核苷酸或是隨機的DNA片斷。

將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價(jià)連接，然后引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類(lèi)。

cDNA克隆是以mRNA為原材料，經(jīng)體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點(diǎn)是：

①有些生物，如RNA病毒沒(méi)有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個(gè)mRNA的信息；

③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發(fā)育階段表達出來(lái)的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個(gè)生物的完整遺傳信息。

方法

DNA片段的制備

常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產(chǎn)生cDNA。

載體DNA的選擇

分子克隆載體

①質(zhì)粒：質(zhì)粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒DNA可通過(guò)轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態(tài)，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個(gè)選擇標記的特點(diǎn)。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長(cháng)約49kb，約含50個(gè)基因，其中50%的基因對噬菌體的生長(cháng)和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進(jìn)行改造后組建一系列具有不同特點(diǎn)的載體分子。λ載體系統最適用于構建真核生物基因文庫和cDNA庫。

M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主復制，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點(diǎn)突變和核酸雜交。

③柯斯(Cos)質(zhì)粒：是一類(lèi)帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體－質(zhì)粒混合物。此類(lèi)載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類(lèi)載體常被用來(lái)構建高等生物基因文庫。

DNA片段與載體連接

分子克隆

DNA分子與載體分子連接是克隆過(guò)程中的重要環(huán)節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱(chēng)之為粘性末端，用同一種限制性?xún)惹忻赶疍NA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性?xún)惹忻鸽m然識別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來(lái)，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性?xún)惹忻缸R別位點(diǎn)的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性?xún)惹忻缸饔煤缶蜁?huì )產(chǎn)生粘性末端。

連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質(zhì)粒為載體時(shí)，形成線(xiàn)性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時(shí)，形成環(huán)狀分子，比率常為1∶1。

引入寄主細胞

常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過(guò)的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養基上，再根據實(shí)驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無(wú)轉化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類(lèi)侵染宿主菌的過(guò)程稱(chēng)為轉導，一般轉導的效率比轉化高。

克隆的選擇

①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會(huì )從原來(lái)的混濁變?yōu)榍辶粒贿€有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變?yōu)闊o(wú)色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。

②間接篩選：有引起載體分子帶有一個(gè)或多個(gè)抗藥性標記基因，當外源DNA插入到抗藥基因區后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個(gè)抗藥性基因，當外源基因插入到B基因區后，便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A(yíng)藥培養基上正常生長(cháng)而不能在B藥培養上生長(cháng)的便是重組分子。

③核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標記的核酸探針進(jìn)行雜交。陽(yáng)性點(diǎn)的位置就是所需要的克隆。

④免疫學(xué)方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進(jìn)行原位雜交，選擇特異的克隆。

重要意義與應用

分子克隆技術(shù)是70年代才發(fā)展起來(lái)的，它的出現和應用開(kāi)辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，打開(kāi)了人類(lèi)了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng )造新物種的大門(mén)。它的成就對于工業(yè)、農牧業(yè)和醫學(xué)產(chǎn)生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大危機開(kāi)拓一條新的出路。

在醫學(xué)方面

利用分子克隆技術(shù)已將胰島素，人、牛和雞的生長(cháng)激素、人的干擾素、松弛素、促紅細胞生長(cháng)激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發(fā)酵工業(yè)進(jìn)行了大規模生產(chǎn)。還可提高微生物本身所產(chǎn)生的蛋白酶類(lèi)和抗生素類(lèi)藥物的產(chǎn)量。

在基因治療方面

通過(guò)遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時(shí)可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血癥，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血癥患者的離體培養細胞，發(fā)現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，并確實(shí)能代謝半乳糖。

在工業(yè)生產(chǎn)方面

以分子克隆技術(shù)為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程，四者緊密聯(lián)系、常綜合利用。許多化學(xué)試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環(huán)氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術(shù)得到產(chǎn)品。在環(huán)境保護方面，人們根據需要進(jìn)行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創(chuàng )造一些對有害物質(zhì)降解能力更強的新菌種，以分解工業(yè)污水中的有毒物質(zhì)。在食品工業(yè)方面，細菌可為人類(lèi)生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖等。

在農業(yè)生產(chǎn)方面

植物遺傳工程對提高農作物的產(chǎn)量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。

分子克隆相關(guān)的文章

記憶障礙

記憶障礙是以遺忘和記憶錯誤為特征的一種精神心理科疾病。多因癡呆、腦外傷、嚴重應激事件、柯薩可夫綜合征等多種疾病導致遺忘或記憶錯誤。記憶障礙主要表現：記憶減弱、遺忘、錯構、虛構、潛隱記憶等癥狀。記憶障礙主要通過(guò)病因治療等改善癥狀。記憶障礙常因遺忘和記憶錯誤給生活和工作帶來(lái)不便。記憶障礙的預后與其病因有

奈奈（《名偵探柯南》電影中的人物）

小山內奈奈是《名偵探柯南》電影《第十四個(gè)目標》中的人物。（第十四個(gè)目標講述了一個(gè)因交通意外而失去味覺(jué)的調酒師所展開(kāi)的瘋狂報復的故事，此劇秉承了《柯南》系列一貫的作風(fēng)：完美主義變態(tài)的犯罪策劃者，驚險的爆破場(chǎng)面，以及接連發(fā)生的兇殺案。唯一的例外是加入了小蘭的父親毛利小五郎和前妻妃英里的感情糾葛戲。華麗的

克倫威爾皇家空軍學(xué)院

克倫威爾皇家空軍學(xué)院是世界歷史上最悠久的軍事飛行學(xué)院，其下轄第3飛行訓練學(xué)校、中央飛行學(xué)校、基礎飛行訓練司令部、特別地面訓練系等教育機構，還管理著(zhù)4個(gè)訓練基地和遍布于全國的16個(gè)大學(xué)航空訓練中隊。

農業(yè)經(jīng)濟學(xué)（清華大學(xué)出版社出版的圖書(shū)）

小編整理：《農業(yè)經(jīng)濟學(xué)》是一本由高等教育出版社出版的教育部高等學(xué)校農業(yè)經(jīng)濟管理類(lèi)專(zhuān)業(yè)核心課程教材，主編是傅新紅。這本書(shū)的內容涵蓋了農業(yè)與農業(yè)經(jīng)濟學(xué)、農業(yè)自然資源要素、農業(yè)社會(huì )經(jīng)濟要素、農業(yè)生產(chǎn)要素配置：農業(yè)經(jīng)營(yíng)方式、農業(yè)產(chǎn)業(yè)結構與布局、農業(yè)經(jīng)濟制度及其演變、農

西安市（中國陜西省下轄地級市，國家中心城市）

西安市(英文名：Xian),中華人民共和國陜西省下轄地級市，是國家中心城市、副省級城市、全國特大城市，市政府位于未央區鳳城八路109號；西安位于黃河流域中部關(guān)中盆地，截至2022年年底，西安市下轄11個(gè)區、2個(gè)縣、7個(gè)國家級開(kāi)發(fā)區，常住人口1299.59萬(wàn)人。總面積為10,752平方千米。西安總人口

巴里（意大利東南部的海港城市）

巴里市位于意大利東南部，坐落在瀕臨亞得里亞海的肥沃平原上，是意大利通向巴爾干半島和東地中海的主要港口。