精選百科
本文由作者推薦
轉染
真核細胞導入外源DNA的過(guò)程
基本信息
| 中文名 | 轉染 |
| 外文名 | transfection |
| 分類(lèi) | 瞬時(shí)轉染和穩定轉染 |
| 學(xué)科 | 生物學(xué) |
簡(jiǎn)介
細胞化學(xué)轉染
常規轉染技術(shù)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)轉染，一類(lèi)是穩定轉染（永久轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細胞中可存在多個(gè)拷貝數，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時(shí)內（依賴(lài)于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測。后者也稱(chēng)穩定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標記，如來(lái)氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。
轉染技術(shù)的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例，細胞數量，培養及檢測時(shí)間等。
分類(lèi)
化學(xué)
包括：
1.DEAE-葡聚糖法
轉染示意圖
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉染法，因為試劑易取得，價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉染和穩定轉染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養的細胞上，通過(guò)細胞胞膜的內吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過(guò)抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.
3.人工脂質(zhì)體法。
人工脂質(zhì)體法采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學(xué)方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長(cháng)度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì)。此外，脂質(zhì)體體外轉染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達和穩定表達，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導DNA和RNA轉入動(dòng)物和人的體內用于基因治療。LipoFiter 脂質(zhì)體轉染試劑(LipoFiterLiposomalTransfectionReagent)是一種適合于把質(zhì)粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白復合物轉染到培養的真核細胞中的高效陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉染試劑。它可以和帶負電荷的核酸結合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時(shí)被內吞成為內體進(jìn)入細胞質(zhì)，隨后DNA復合物被釋放進(jìn)入細胞核內，至于DNA是如何穿過(guò)核膜的，其機理目前還不十分清楚。
物理
包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍等，顯微注射雖然費力，但是非常有效的將核酸導入細胞或細胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉基因動(dòng)物，但卻不適用于需要大量轉染細胞的研究。電穿孔法常用來(lái)轉染如植物原生質(zhì)體這樣的常規方法不容易轉染的細胞。電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內。導入的效率與脈沖的強度和持續時(shí)間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內，這種方法適用于培養的細胞核在體的細胞。
實(shí)驗
細胞轉染實(shí)驗
目的
基因轉染示意圖
原理
外源基因進(jìn)入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進(jìn)入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時(shí)轉染方法多采用脂質(zhì)體法。
利用脂質(zhì)體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉染的時(shí)間長(cháng)短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。
步驟
細胞傳代
(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開(kāi)。
(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X10 個(gè)細胞加入一個(gè)35mm培養皿。
(9)將培養皿轉入CO培養箱中培養，第二天轉染。
1）轉染試劑的準備
B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來(lái)轉染細胞。在一個(gè)轉染管中加入合適體積的無(wú)血清培養基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。
5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。
6)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無(wú)血清培養基清洗一次。
7）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個(gè)小時(shí)。
第二次細胞傳代
3）在正常條件下培養24小時(shí)后按照染色要求條件固定。
篩選
轉染細胞篩選
不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。
1) 提前24 小時(shí)在96 孔板或24 孔板中接種細胞8 孔，接種量以第二天長(cháng)成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養過(guò)夜。
2) 將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3) 培養10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準，一般為400-800μg/ml,篩選穩定表達克隆時(shí)可比該濃度適當提高一個(gè)級別維持時(shí)使用篩選濃度的一半.
2．轉染按前面的步驟進(jìn)行。
3．轉染72 小時(shí)后按1:10 的比例將轉染細胞在6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6 孔板內可見(jiàn)單個(gè)細胞，繼續培養可見(jiàn)單個(gè)細胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。
1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶，將濾紙片貼在單細胞集落上10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24 孔板中繼續加壓培養。細胞在24 孔板中長(cháng)滿(mǎn)后轉入25cm 培養瓶中，長(cháng)滿(mǎn)后再轉入75cm 培養瓶中培養。
2) 有限稀釋法：將細胞消化下來(lái)后做連續的10 倍稀釋?zhuān)?0-2—10-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96 孔板中培養，7-10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(cháng)的孔再一次進(jìn)行克隆。
4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。
研究進(jìn)展
轉染技術(shù)
轉染試劑
轉染效率
線(xiàn)型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過(guò)去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時(shí)細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗中發(fā)現這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。
有的產(chǎn)品采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉染效率，當所形成復合物進(jìn)入細胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細胞內水解，使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細胞毒性的小分子PEI，這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內應用也具有重要的意義。
現在最新的轉染試劑是采用納米材料制作，如Engreen，其原理是：分子內含有許多氨基，在生理PH下會(huì )發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和DNA質(zhì)粒表面的負電荷，使DNA分子由伸展結構壓縮為體積相對較小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。轉染復合物主要是通過(guò)細胞內吞作用將DNA轉移進(jìn)入細胞，形成內含體(endosome)，DNA從內含體釋放，進(jìn)入細胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內轉錄、表達。通過(guò)納米技術(shù)生產(chǎn)出的轉染試劑在納米尺度表現出結合保護DNA能力強、毒性低的獨特性能。
轉染相關(guān)的文章
法魯克一世（拉丁文轉寫(xiě)：Fārūq），全名穆罕默德·法魯克（Muhammad Fārūq），第二任埃及和蘇丹國王，努比亞、科爾多凡和達爾富爾的統治者（1936年至1952年在任）。
cairoCairo是一個(gè)2D圖形庫，支持多種輸出設備。基本信息外文名cairo主要優(yōu)點(diǎn)方便頁(yè)面的再次利用目的同時(shí)能利用硬件加速器作用支持多種輸出設備詳細介紹目前支持的輸出目標包括XWindow，Quartz，Win32，image.buffers，PostS
埃及鎊是埃及的官方貨幣，其紙幣單位為埃及鎊，輔幣單位為皮阿斯特。1埃及鎊可以?xún)稉Q0.383至0.4326元人民幣，硬幣種類(lèi)有1、5、10的皮阿斯特，紙幣有分5、10、25、50的皮阿斯特及1、5、10、20、50、100的埃及鎊。1鎊等于100皮亞斯特或1000米利姆。自2022年7月6日起，新的1
亞得里亞海，意大利語(yǔ)作Mare Adriatico，英語(yǔ)作Adriatic sea。地中海的一個(gè)大海灣。長(cháng)約800公里(500哩)，平均寬160公里(100哩)，平均水深444公尺(1,457呎)，最深處1,324公尺(4,035呎)，面積131,050平方公里(50,590平方哩)。北淺、南深，平
蕈（拼音：xùn）樹(shù)（學(xué)名：Altingia chinensis (Champ. ex Benth.) Oliv. ex Hance）為蕈樹(shù)科（Altingiaceae）蕈樹(shù)屬（Altingia）常綠喬木，別名山鋰枝、阿丁楓等。蕈樹(shù)原產(chǎn)于中國長(cháng)江流域以南的各地，越南也有分布，多生長(cháng)在海拔400-16
南歐歐洲南部的簡(jiǎn)稱(chēng)南歐（southern Europe）是歐洲南部的簡(jiǎn)稱(chēng)，范圍包括伊比利亞半島、亞平寧半島及巴爾干半島南部，包括西班牙、葡萄牙、安道爾、意大利、希臘、馬耳他、梵蒂岡、圣馬力諾、斯洛文尼亞、克羅地亞、阿爾巴尼亞、羅馬尼亞、保加利亞、塞爾維亞、黑山、馬其頓和波斯尼亞和黑塞哥維那共17個(gè)國家，也稱(chēng)為地中海歐洲，因為大多南歐國家靠近地中海。面積約為166萬(wàn)多平方公里。南歐隔著(zhù)地中海與亞、非
尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
作者
