轉(zhuǎn)染（真核細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA的過(guò)程）
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轉(zhuǎn)染
真核細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA的過(guò)程
轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。從本質(zhì)上講，和轉(zhuǎn)化沒(méi)有根本的區(qū)別。無(wú)論是轉(zhuǎn)染還是轉(zhuǎn)化，其關(guān)鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。所以在習(xí)慣上，人們往往也通稱(chēng)轉(zhuǎn)染為廣義的轉(zhuǎn)化。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）兩大類(lèi)。
基本信息
| 中文名 | 轉(zhuǎn)染 |
| 外文名 | transfection |
| 分類(lèi) | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
| 學(xué)科 | 生物學(xué) |
簡(jiǎn)介
細(xì)胞化學(xué)轉(zhuǎn)染
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類(lèi)是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴(lài)于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱(chēng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。
分類(lèi)
化學(xué)
包括：
1.DEAE-葡聚糖法
轉(zhuǎn)染示意圖
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因?yàn)樵噭┮兹〉茫瑑r(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過(guò)細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過(guò)抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA免受降解.
3.人工脂質(zhì)體法。
人工脂質(zhì)體法采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長(zhǎng)度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì)。此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)入動(dòng)物和人的體內(nèi)用于基因治療。LipoFiter 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(LipoFiterLiposomalTransfectionReagent)是一種適合于把質(zhì)粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的高效陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。它可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，至于DNA是如何穿過(guò)核膜的，其機(jī)理目前還不十分清楚。
物理
包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍等，顯微注射雖然費(fèi)力，但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來(lái)轉(zhuǎn)染如植物原生質(zhì)體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體的細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
目的
基因轉(zhuǎn)染示意圖
原理
外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。
利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。
材料器材
（1）材料
293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）
（2）器材
步驟
細(xì)胞傳代
(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開(kāi)。
(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X10 個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。
(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。
6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。
7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。
第二次細(xì)胞傳代
3）在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。
篩選
轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選
不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn)，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的最低作用濃度。
1) 提前24 小時(shí)在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞8 孔，接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3) 培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn)，一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使用篩選濃度的一半.
2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。
3．轉(zhuǎn)染72 小時(shí)后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。
1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶，將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24 孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中，長(zhǎng)滿(mǎn)后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
2) 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來(lái)后做連續(xù)的10 倍稀釋?zhuān)?0-2—10-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96 孔板中培養(yǎng)，7-10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆。
4. ELISA 或Western blot 檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。
研究進(jìn)展
轉(zhuǎn)染技術(shù)
轉(zhuǎn)染試劑
轉(zhuǎn)染效率
線(xiàn)型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
有的產(chǎn)品采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。
現(xiàn)在最新的轉(zhuǎn)染試劑是采用納米材料制作，如Engreen，其原理是：分子內(nèi)含有許多氨基，在生理PH下會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和DNA質(zhì)粒表面的負(fù)電荷，使DNA分子由伸展結(jié)構(gòu)壓縮為體積相對(duì)較小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。轉(zhuǎn)染復(fù)合物主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體(endosome)，DNA從內(nèi)含體釋放，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。通過(guò)納米技術(shù)生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)染試劑在納米尺度表現(xiàn)出結(jié)合保護(hù)DNA能力強(qiáng)、毒性低的獨(dú)特性能。
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