基因轉染技術(shù)（基因轉染技術(shù)）

簡(jiǎn)介

基因轉染技術(shù)就是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內，并在細胞內表達。

基因轉染技術(shù)已廣泛應用于基因組功能研究和基因治療研究。

轉染方法

轉染指通過(guò)生化或者物理方法將目的基因導入真核細胞中。

感染指通過(guò)病毒介導，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來(lái)感染靶細胞。

基因運載系統

將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞，需要應用某一基因運載系統，這一系統可概括為兩大類(lèi)：非病毒方法和病毒方法

非病毒方法包括以下幾種方法：

陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導的轉染

（1）DEAE-葡聚糖和polybrene聚陽(yáng)離子法：帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。DEAE－葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉染。

（2）磷酸鈣共沉淀法：將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀，附著(zhù)于細胞膜并經(jīng)過(guò)細胞內吞作用進(jìn)入細胞質(zhì)。

該方法的轉化效率通常很低。

（3）脂質(zhì)體染法：脂質(zhì)體能在體內或體外提供運載外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入細胞的載體。脂質(zhì)體介導的基因轉移的最大優(yōu)勢在于能在活體內應用。

2、生物方法

（1）直接注射法：將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入DNA鏈進(jìn)行表達，在肌細胞中，基因表達可持續數月。

（2）受體介導的基因轉移：依靠受體介導的細胞內吞途徑以轉移外源基因。受體介導的基因轉移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復合體，而這種多肽能為細胞表面的受體所識別。如若將DNA在體內運送至肝內，可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過(guò)細胞內吞過(guò)程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應用該方法轉移的外源基因在活體內的表達持續時(shí)間較短，在評估實(shí)際應用前景上還存在一些問(wèn)題。

（3）精子載體法：用精子和NDA（吡啶核甘酸輔酶）-劑孵育，可捕獲得DNA。通過(guò)受精過(guò)程，將外源性基因導入受精卵，大大簡(jiǎn)化了轉基因動(dòng)物的制備過(guò)程。這項轉染方法是才發(fā)展出來(lái)應用在魚(yú)類(lèi)轉殖的最新技術(shù)，它最大有點(diǎn)就是簡(jiǎn)單方便。

顯微注射法

（1）微粒子轟擊法（基因槍?zhuān)?：在真空狀態(tài)下，利用粒子加速器將外面包裹了外源基因DNA的金顆粒或鎢粉微顆粒進(jìn)行加速，打入完整的細胞中，從而使外源基因DNA得以在靶細胞中穩定轉化并有可能獲得表達。實(shí)驗結果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細胞中表達。

（2）顯微注射法：在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細胞玻璃針直接注入細胞，該法適合于各種培養生長(cháng)的細胞，但需要一定的設備和操作技巧。

（3）電穿孔法：電穿孔通過(guò)將細胞暴露在短暫的高場(chǎng)強電脈沖中轉導分子。即利用脈沖場(chǎng)將DNA導入培養細胞。電脈沖和場(chǎng)強的優(yōu)化對于成功的轉染很重要。

病毒作為基因轉染是基因遞送良好的工具，病毒載體的優(yōu)點(diǎn)有：

（1）在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩定的遺傳成分；

（2）可能將有缺陷的或突變的基因置于病毒調節信號的控制下以進(jìn)行研究；

（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分，并能進(jìn)行分離；

（4）轉移效率較高。其主要缺點(diǎn)是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp。

常用的病毒載體有下列幾種：

1、逆轉錄病毒載體

逆轉錄病毒為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA上，病毒進(jìn)入細胞通過(guò)逆轉錄作用，病毒RNA即轉變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進(jìn)入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱(chēng)為原病毒。在原病毒的兩端各有一長(cháng)末端重復序列（LTR），LTR內側還有為復制所必需的其他順序，包括包裝信號。常用的逆轉病毒載體有CMV和SV。

2、DNA病毒載體

主要有腺病毒相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體。這一類(lèi)是利用病毒載體介導的基因轉移，以其高轉染率和良好的靶向性成為腫瘤基因治療的有效方法。對DNA病毒載體的研究是基因治療研究中的重點(diǎn)領(lǐng)域。

基本過(guò)程

被用于作靶基因轉染的細胞，其生長(cháng)狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長(cháng)的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿(mǎn)培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時(shí)換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時(shí)換一次新鮮培養液。

用于轉染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其它化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應在1.8以上。DNA的質(zhì)量和純度能影響某些細胞系的轉染效率，可以通過(guò)CsCl梯度法或標準柱層析法進(jìn)行純化。

病毒載體轉染過(guò)程

1.利用基因表達產(chǎn)物篩選法

（1）標記基因篩選法???在載體上引入一個(gè)標記基因，或同時(shí)導入標記基因，在轉染后的適當時(shí)間選用合適劑量的選擇培養基，篩選標記基因表型，那些已導入外源基因的細胞將存活下來(lái)。

（2）基因缺陷型受體細胞的選擇性?????以基因缺陷型細胞作為靶細胞，將正常基因導入基因缺陷型靶細胞后，使用選擇性培養基進(jìn)行篩選。

（3）基因共轉染技術(shù)??將目的基因表達載體DNA和標記基因表達載體DNA混合后共同轉移到靶細胞中，分別使用標記基因和目的基因對應的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復合轉導的轉化子。

2.分子生物學(xué)方法

外源基因是否真的轉入靶細胞必須用分子雜交方法進(jìn)行證實(shí)。常用的方法有原位雜交、Southern雜交。其中主要問(wèn)題是探針的選擇。

外源基因的表達和檢測

在篩選出轉化子后還需要鑒定轉導細胞中外源基因的表達狀況。其中包括對目的基因和標記基因的鑒定。常用方法有原位雜交、Northern雜交、免疫組織化學(xué)染色等，原位及Northern雜交是檢測外源基因轉錄出的mRNA,后者則是檢測外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。

主要應用

植物基因轉染應用過(guò)程

2?、用于基因治療

3?、用于異種器官移植

4?、用于改良動(dòng)植物品種和生產(chǎn)性能

5?、用于生產(chǎn)藥用蛋白和保健蛋白

6?、用于生產(chǎn)人抗體