無(wú)血清培養基（用于制備單克隆抗體等的培養基）

基本介紹

無(wú)血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長(cháng)時(shí)間生長(cháng)繁殖的合成培養基。

無(wú)血清培養基的基本配方：基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養時(shí)，多數呈貼壁生長(cháng)或兼性貼壁生長(cháng)；而當其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養基中生長(cháng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長(cháng)。

組分簡(jiǎn)介

1.促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長(cháng)，這種情況下無(wú)血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著(zhù)重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2.促生長(cháng)因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長(cháng)因子。激素也是刺激細胞生長(cháng)、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

3.酶抑制劑：培養貼壁生長(cháng)的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

4.結合蛋白和轉運蛋白：常見(jiàn)如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無(wú)血清培養基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常見(jiàn)的。

使用方法

目前，血清仍是動(dòng)物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長(cháng)狀況不良時(shí)，常常會(huì )先使用有血清的培養液進(jìn)行培養，待細胞生長(cháng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養液。細胞轉入無(wú)血清培養基培養要有一個(gè)適應過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養。在降低過(guò)程中要注意觀(guān)察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長(cháng)期培養于無(wú)血清培養基而不發(fā)生改變的。細胞轉入無(wú)血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細胞適應無(wú)血清培養，關(guān)鍵的是使所培養細胞：

1.處于對數生長(cháng)中期

2.>90% 活細胞率

3.適應時(shí)以較高的起始細胞接種

細胞適應無(wú)血清培養基的方法

1.直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無(wú)血清培養基（SFM）中。

一些類(lèi)型細胞可直接從包含血清的培養基適應無(wú)血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時(shí)，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時(shí)，細胞完全適應了無(wú)血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml，細胞活率在90%時(shí)，貯備的適應了無(wú)血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

2.連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無(wú)血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

（1）以2倍正常接種密度接種生長(cháng)活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25%SFM 混合培養基中，傳代培養。

（2）當細胞密度>5×10細胞/ml時(shí)，以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

（3）以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，25%有血清培養基和75% SFM中傳代培養。

（4）當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml（接種后4到6天），在100%SFM培養基中傳代培養。

（5）每隔3到5天，當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml，細胞活率在90%時(shí)，貯備的適應了無(wú)血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應過(guò)程中，最好不要讓細胞生長(cháng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過(guò)下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培養基。每次適應改變血清比例時(shí)，傳代細胞2到3次。

培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(cháng)的延遲可能會(huì )發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(cháng)率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配制無(wú)血清培養液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無(wú)血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養能否成功的關(guān)鍵因素之一。

主要優(yōu)缺點(diǎn)

1.可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細胞培養和實(shí)驗結果的重復性。

2.避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清組分對實(shí)驗研究的影響。

4.有利于體外培養細胞的分化。

5.可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化。

缺點(diǎn)：

1.細胞在無(wú)血清培養基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。

2.成本較高。

3.針對性很強，一種無(wú)血清培養基僅適合某一類(lèi)細胞的培養。

培養細胞配方

1.神經(jīng)細胞，干細胞，PC12細胞

成份 終濃度

葡萄糖－－0.6%

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰島素－－2.5μg/ml

轉鐵蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸鈉－－30nM

青霉素－－50mg/ml

鏈霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2.各類(lèi)小鼠胚胎癌細胞系培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纖粘連蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分鐘）

胰島素 1000.0ug

轉鐵蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纖維細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制劑 0.1%

胰島素 10.0ug/ml

轉鐵蛋白 25.0ug/ml

纖粘連蛋白 5.0ug/ml

4.雜交瘤細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO1.2g/L

HEPES 15mM

胰島素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

轉鐵蛋白 35.5ug/ml

應用：無(wú)血清培養基和試劑被廣泛的應用于培養哺乳動(dòng)物和無(wú)脊動(dòng)物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數的無(wú)血清產(chǎn)品含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應器剪切力，提供細胞貼壁所需的基質(zhì)，作為脂類(lèi)和其他生長(cháng)因子的載體等。

種類(lèi)分類(lèi)

LONZA公司 無(wú)血清培養基

12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium) 500ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：一種通用的無(wú)血清培養劑

適用范圍：培養貼壁和懸浮哺乳動(dòng)物細胞，疫苗生產(chǎn)中病毒顆粒的制備

產(chǎn)品：

77232 PC-1Complete Serum-free Medium 500ml

77230 PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement) 10L

344022 PC-1 Supplement (50) 10ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：是一種低蛋白，無(wú)血清培養基。PC-1培養基旨在應用于各種研究和工業(yè)用途，使用限定成份配制的培養基確保在維持最低蛋白成分同時(shí)使細胞獲得最佳的生長(cháng)狀態(tài)。

適用范圍：培養原代細胞和貼壁依賴(lài)性細胞

產(chǎn)品：

12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES) 500ml

12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Protein-free basal medium without L-glutamine) 500ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：用于支持多種貼壁信賴(lài)性細胞在低血清濃度下的正常生長(cháng)的限定培養基。

適用范圍：培養貼壁信賴(lài)性細胞

產(chǎn)品：

12-724Q UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L

12-715F UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL

17-811A UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：培養基最適于培養轉染和未轉染的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞，表達重組蛋白質(zhì)。

適用范圍：培養CHO細胞; 重組蛋白的合成。

產(chǎn)品：12-749Q UltraMDCK Meida 1L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：是一種無(wú)血清限定培養劑，適于高/低平板密度培養MADIN-DABBY犬腎細胞（MDCK）

適用范圍：培養供體外診斷（IVD）用的MDCK細胞

產(chǎn)品：

12-764Q PRO 293A-CDM 1L

12-765Q PRO 293S-CDM 1L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：用于293細胞（轉化的人胚腎細胞）培養Pro293限定培養基系統是專(zhuān)為促進(jìn)293細胞重組蛋白的合成和下游反應而開(kāi)發(fā)的。這些配方不需要任何動(dòng)物來(lái)源的成分即可支持高密度的培養

適用范圍：293細胞重組蛋白和合成

產(chǎn)品：12-730Q Insect-XPRESS Medium 1L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：采用一種無(wú)蛋白配方，適合培養來(lái)源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆蟲(chóng)細胞系。

適用范圍：桿狀病毒的增殖，重組蛋白的表達。

產(chǎn)品：77203 HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：HL-1TM完全無(wú)血清培養基是一種限定培養基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM完全無(wú)血清培養基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。

適用范圍：雜交瘤細胞和淋巴細胞來(lái)源的分化細胞的無(wú)血清培養。

產(chǎn)品：12-723 BUltraDOMA Medium 500ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：適用于中空纖維反應器中進(jìn)行中，鼠和嵌合雜交瘤細胞的培養及上述細胞的批量培養。

適用范圍：雜交瘤細胞的培養，單克隆抗體的制備。

產(chǎn)品：12-727F FUltraDOMA-P.F.Protein-free Medium 500ml

08-024B Ultra DOMA-P.F.Protein-free Medium 10L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：一種不含蛋白的培養基，適于鼠，人和嵌合細胞來(lái)源的雜交瘤細胞系的培養。

適用范圍：雜交瘤細胞和骨髓瘤細胞的培養，單克隆抗體的制備。

XVIVO系利產(chǎn)品

產(chǎn)品：

04-380Q X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-743Q X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：為了有助于在無(wú)血清環(huán)境中制備淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)而設計的。

產(chǎn)品：

04-418Q X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-744Q X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：在組成上和X-VIVO 10相似，并且經(jīng)過(guò)調整優(yōu)化使之適合于無(wú)血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周學(xué)及人類(lèi)腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖。同時(shí)還用于維持人類(lèi)單核細胞、巨噬細胞及細胞系、粒細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長(cháng)。

產(chǎn)品：04-448Q X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：經(jīng)過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化有助于單核細胞耗竭的高密度的外周淋巴細胞制備LAK細胞。

價(jià)格：待定

存儲條件：2℃-8℃

三種培養的部分細胞類(lèi)型應用如下：

人和鼠淋巴因子激活殺傷細胞（LAK）；外周血淋巴細胞（PBL）；人和鼠腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）；人T細胞；人和鼠巨噬細胞；人和鼠造血干細胞（克隆形成和增殖）；人體組織的冰凍保存。

X-VIVO 產(chǎn)品的其他應用包括：

PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰凍保存和移植；人單核細胞和巨噬細胞的培養；干細胞的培養；樹(shù)突狀細胞的培養。