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熒光顯微鏡
研究細胞內物質(zhì)吸收的儀器
基本信息
| 中文名 | 熒光顯微鏡 |
| 外文名 | Fluorescence microscope |
| 用途 | 研究細胞內物質(zhì)的吸收、運輸等 |
| 注意事項 | 在暗室中檢查，按照說(shuō)明書(shū)使用等 |
| 釋義 | 物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究工具之一 |
| 光源 | 紫外線(xiàn) |
收起
鑒別
熒光顯微鏡
1.照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；
2.光源為紫外光，波長(cháng)較短，分辨力率高于普通顯微鏡；
3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線(xiàn)，用以保護人眼。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學(xué)系統等主要部件組成。是利用一定波長(cháng)的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統放大以觀(guān)察標本的熒光圖像。
工作原理
光源
熒光顯微鏡工作原理
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓?jiǎn)?dòng)（約為15000V），啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開(kāi)一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數。燈泡在使用過(guò)程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線(xiàn)強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調節燈泡發(fā)光中心的系統，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。
中國研制的一種簡(jiǎn)易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應用。
濾色系統
濾色系統是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠(chǎng)家名稱(chēng)常不統一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，后面字母代表玻璃，數字代表型號特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母；中國產(chǎn)品的名稱(chēng)已統一用拼音字母表示，如相當于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過(guò)有的濾板也可以透光分界濾長(cháng)命名，如K530，就是表示壓制濾長(cháng)530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠(chǎng)家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠(chǎng)的NO：5-58，即相當于BG12。
1．激發(fā)濾板 根據光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(cháng)范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過(guò)。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號為QB24（BG12）。
開(kāi)始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長(cháng)適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠(chǎng)的FITC專(zhuān)用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應波長(cháng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過(guò)可見(jiàn)光、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾板：能通過(guò)510nm以上波長(cháng)的光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過(guò)460nm以上波長(cháng)的光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。
反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見(jiàn)光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
聚光鏡
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀(guān)察。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無(wú)色濾板（不透過(guò)紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀(guān)察舒適，可能發(fā)現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀(guān)察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀(guān)察很少需要這種聚光器。
物鏡
各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長(cháng)范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀(guān)察很方便。
落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后，波長(cháng)短的部分（紫外和紫藍）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(cháng)長(cháng)的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見(jiàn)光長(cháng)波區，可透過(guò)濾鏡而到達目鏡觀(guān)察，熒光圖像的亮度隨著(zhù)放大倍數增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀(guān)察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱(chēng)之為落射熒光顯微鏡。
CCD
使用范圍
一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡即可以達到想要的成像效果，但在某些情況下，比如說(shuō)當熒光比較微弱的情況下，僅僅通過(guò)熒光顯微鏡并不能達到理想的拍攝效果，或者大家希望可以將拍攝的熒光圖片上傳的電腦生面預覽，修改甚至發(fā)表學(xué)術(shù)論文，這時(shí)候沒(méi)有熒光顯微鏡CCD是不能達到要求的。
產(chǎn)品特點(diǎn)
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕捉能力，能夠捕捉到極其微弱的熒光，因此成像能力好，此外，很多熒光冷CCD生產(chǎn)上搜對此類(lèi)CCD作了制冷處理，使得此類(lèi)CCD的噪音大大降低，信噪比得以很大的提高。由于其方便應用效果，此類(lèi)CCD相機被廣泛應用于熒光顯微鏡。
標本制作要求
熒光顯微鏡的標本制作要求
1、載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
2、蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用于涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長(cháng)的光起到不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標本。
3、標本
組織切片或其他標本不能太厚，若太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀(guān)察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。
4、封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。
5、鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。
使用方法
（1）打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預熱15min才能達到最亮點(diǎn)。
（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。
（3）用低倍鏡觀(guān)察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。
（4）放置標本片，調焦后即可觀(guān)察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀(guān)察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動(dòng)，否則會(huì )不穩定，影響汞燈壽命。
（5）觀(guān)察。例如：在熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，觀(guān)察到經(jīng)0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。
注意事項
（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
（2）應在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開(kāi)始觀(guān)察標本。
（3）防止紫外線(xiàn)對眼睛的損害，在調整光源時(shí)應戴上防護眼鏡。
（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線(xiàn)照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過(guò)2～3h。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時(shí)間，保護光源。天熱時(shí)，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應避免數次點(diǎn)燃光源。
（6）標本染色后立即觀(guān)察，因時(shí)間久了熒光會(huì )逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。長(cháng)時(shí)間的激發(fā)光照射標本，會(huì )使得熒光衰減和消失現象，故應盡可能縮短照射時(shí)間。暫時(shí)不觀(guān)察時(shí)可用擋光板遮蓋激發(fā)光。
（7）標本觀(guān)察時(shí)候應采用無(wú)熒光油，應避免眼睛直視紫外光源。
研究發(fā)現
參考資料
[1]
國際最新研發(fā)出一低成本裝置 可將智能手機轉化成熒光顯微鏡 · 環(huán)球網(wǎng)[引用日期2023-03-10]
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