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乳酸脫氫酶
NAD依賴性激酶
基本信息
| 中文名 | 乳酸脫氫酶 |
| 別名 | LD或LDH |
| 外文名 | lactate dehydrogenase |
| 影響 | 可用于心肌疾病的診斷 |
| 所屬學(xué)科 | 醫(yī)學(xué)檢驗 |
| 性質(zhì) | 氧化還原酶 |
| 作用 | 糖酵解酶之一 |
| 亞基 | LDHA、LDHB、LDHC |
收起
測定方法
參考值
血清：35-88U/L（pH8.8-9.0 ，30°C）； 100-225U/L（pH8.8-9.0，37°C）。
尿：42-98U/L（pH8.8-9.0，25°C，連續(xù)監(jiān)測LD-L法）。
血清：200-380U/L（連續(xù)監(jiān)測LD-P法）。
血清：95-200U/L（pH7.4 ，30°C ；200-380U/L（pH7.4，37°C）。
腦脊液：7-30U/L（pH7.4，30°C ，比色法）。
注意事項
由于紅細(xì)胞內(nèi)LDH含量比正常血清中LDH活性高1000倍，溶血時血清LDH活性顯著增高，故送檢標(biāo)本不能溶血。由于草酸鹽抑制LDH，故測LDH活性，宜采用血清而不采用血漿。另外，若血清中未除盡血塊，無論在4℃還是室溫存放標(biāo)本，LDH活性都將明顯增高。
分類
根據(jù)結(jié)合輔酶的不同，微生物體一般包含兩種乳酸脫氫酶，NAD-依賴型乳酸脫氫酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依賴型乳酸脫氫酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）兩大類。NAD-非依賴型乳酸脫氫酶，也被稱作呼吸鏈乳酸脫氫酶，在微生物體內(nèi)通常被認(rèn)為是負(fù)責(zé)乳酸氧化的酶類。它們編碼的基因與乳酸利用相關(guān)的乳酸透性酶和調(diào)節(jié)蛋白編碼的基因較近。相較于NAD-非依賴型乳酸脫氫酶，NAD-依賴型乳酸脫氫酶分布范圍更廣泛，在人體、動物以及微生物中都普遍存在。在微生物中，NAD-依賴型乳酸脫氫酶存在于其細(xì)胞質(zhì)中，體外實驗證實：NAD-依賴型乳酸脫氫酶能夠以NADH為輔因子催化丙酮酸還原生成乳酸，并且氧化NADH為NAD，同時該酶在特定的條件下可以催化逆反應(yīng)的進(jìn)行，但是活力非常弱，不容易檢測。一般說來，與NAD-依賴型乳酸脫氫酶以NADH為輔因子不同的是NAD-非依賴型乳酸脫氫酶主要利用黃素。NAD-依賴型乳酸脫氫酶也可以在體內(nèi)催化乳酸的氧化，但體外實驗可能需要較高的pH和底物濃度。
乳酸脫氫酶
按其催化底物的構(gòu)型不同，NAD-依賴型乳酸脫氫酶可以分為NAD依賴型-L-乳酸脫氫酶（L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶）和NAD依賴型-D-乳酸脫氫酶（D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶）兩大類，分別催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。研究表明，雖然L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶和D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶均催化丙酮酸合成乳酸，但二者的基因序列不具有相似性或一致性。已知的不同乳桿菌的D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶之間存在40%～50%的氨基酸同源性，而D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶和L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶之間則只存在10%左右的同源性，表明兩種脫氫酶分別由兩個完全不相關(guān)的家族進(jìn)化而來。不僅如此，酶之間的差異也表現(xiàn)在動力學(xué)參數(shù)差異明顯，比如，兩者催化反應(yīng)的反應(yīng)常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km不同。
根據(jù)天然電子受體的不同，可以將NAD-非依賴型乳酸脫氫酶分為三類。第一類為膜蛋白，利用膜醌類作為外部的電子受體；第二類直接利用O2作為電子受體，根據(jù)氧化終產(chǎn)物的不同，又將其細(xì)分為乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸單氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者產(chǎn)生丙酮酸和H2O2，而后者產(chǎn)生乙酸、CO2和H2O；第三類是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的電子受體為細(xì)胞色素c。大多數(shù)L-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶屬于α-羥酸氧化黃素蛋白家族，利用還原型黃素單核苷酸（Flavin mononuleotide，F(xiàn)MN），而所有的D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶均可利用黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）作為電子受體，而不是FMN，它們具有FAD結(jié)合的氧化還原酶/轉(zhuǎn)移酶4的家族特征。此外，D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶還可以利用醌類或細(xì)胞色素c作為電子受體，但是迄今為止，還沒有D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶直接利用O2的相關(guān)報道。Wolin的研究表明，一些鏈球菌LDHs的催化活性絕對依賴于果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-Diphosphate，F(xiàn)DP）。其他鏈球菌、雙歧桿菌屬的所有種、干酪乳桿菌和木糖乳桿菌等都發(fā)現(xiàn)了相似的NAD-非依賴型乳酸脫氫酶。
結(jié)構(gòu)功能
研究表明，L-乳酸脫氫酶（L-LDH）和L-蘋果酸脫氫酶屬于同一家族，而D-乳酸脫氫酶（D-LDH）屬于D-2-羥酸脫氫酶家族。
D-乳酸脫氫酶
大多數(shù)D-乳酸脫氫酶催化是可逆反應(yīng)，極少數(shù)不可逆；對于可逆的D-乳酸脫氫酶來說，只有環(huán)境中乳酸濃度較高時才催化逆反應(yīng)，即催化乳酸合成丙酮酸，來參與細(xì)菌的代謝。
D-乳酸脫氫酶的一級結(jié)構(gòu)比對表明，不同種屬的D-乳酸脫氫酶的氨基酸序列存在較大的差異，但是參與丙酮酸的結(jié)合與催化的氨基酸殘基卻十分保守。Kochhar等的研究顯示L.bulgaricus的D-乳酸脫氫酶是一個由相同亞基組成的二聚體，每個亞基由332個氨基酸殘基組成，分子量為36.8 ku，經(jīng)化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)位于催化中心的三個組氨酸（His205、His296和His303）和Asp259對底物的催化具有十分重要的作用。Kochhar等還發(fā)現(xiàn)，His289也參與了底物結(jié)合，但His289不是D-2-羥基酸脫氫酶家族中保守的氨基酸殘基。另外，通過對Cys殘基的化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)Cys234可能參與底物結(jié)合和催化作用，這在L.helveticus的羥基丙酮酸還原酶中也能得以證實。研究還發(fā)現(xiàn)L.helveticus CNRZ32 的D-乳酸脫氫酶氨基酸序列和D-2-羥基酸脫氫酶家族的D-3-磷酸甘油酸脫氫酶、羥基丙酮酸還原酶和D-2-羥基己酸脫氫酶存在很高的同源性，這也暗示了該酶是D-2-羥基酸脫氫酶家族的一個成員。Razeto等對L.bulgaricus的D-乳酸脫氫酶構(gòu)象進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L. bulgaricus的D-乳酸脫氫酶是一個由兩個相同的亞基構(gòu)成的不對稱酶，A亞基的酶蛋白是典型的“開放”構(gòu)象，而B亞基是典型的“閉合”構(gòu)象。其中NADH的結(jié)合位點主要存在于B亞基中，而在A亞基中僅有30%，同時在底物結(jié)合口袋中有一個硫酸根離子。另外，該研究還建立了丙酮酸分子在活性位點的模型。在閉合域中，存在一簇疏水的氨基酸殘基緊緊圍繞著丙酮酸分子的甲基，在這個疏水氨基酸簇中至少有三個氨基酸殘基（Tyr52、Phe299和Trp135’）決定底物的專一性。研究表明該底物結(jié)合位點有利于閉合域的穩(wěn)定和酶的激活。
L-乳酸脫氫酶
大多數(shù)乳酸菌中不僅存在D-乳酸脫氫酶也存在L-乳酸脫氫酶，L-乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原生成L-乳酸。L-乳酸脫氫酶分為兩型：一類可被FDP激活，屬于別構(gòu)酶；另一類不需要FDP激活，不具有別構(gòu)效應(yīng)。據(jù)Hiroyuki Uchikoba報道，L.pentosus的L-乳酸脫氫酶是一個非異構(gòu)酶，但是它的氨基酸序列和一些細(xì)菌的別構(gòu)LDH具有很高的相似性。該酶的四聚體由相同亞基組成對稱的酶結(jié)構(gòu)。它的活性構(gòu)象和別構(gòu)LDH的構(gòu)象相似。
Kazuhito Arai等的研究表明，Lactobacillus的L-乳酸脫氫酶氨基酸序列中，Glu102、Asp197和Thr246是高度保守的，它們參與了底物的識別；另外，98-110氨基酸殘基構(gòu)成了活性位點環(huán)，它們參與催化反應(yīng)。Arg171的胍基和丙酮酸的羰基形成雙氫鍵，從而使丙酮酸在催化位點中處于正確的結(jié)合方向。研究表明，在L-乳酸脫氫酶的氨基酸序列中同樣存在一個與輔酶NADH結(jié)合的結(jié)構(gòu)域Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-（17Xaa）-Asp，其中該結(jié)構(gòu)域中的Asp決定了L-乳酸脫氫酶的輔酶是NADH，而不是NADPH4]。L.pentosus中L-乳酸脫氫酶的活性位點和其他LDH相似，包括了參與催化與底物結(jié)合的保守氨基酸殘基，如Aspl68、Argl71和Hisl955。其中，Argl71在底物的結(jié)合中起著重要作用；另外，Hisl95主要在催化過程中作為質(zhì)子供體和受體。值得注意的是，雖然Bacillus 和Lactobacillus的L-乳酸脫氫酶在進(jìn)化關(guān)系上存在很近的親緣關(guān)系，但是活性位點環(huán)的氨基酸殘基也存在差異，如101位Bacillus是Asn，而Lactobacillus是Pro。這表明L-乳酸脫氫酶是否來自好氧或厭氧的革蘭氏陽性菌可以由這個位置的氨基酸殘基是Asn101還是Pro101來識別。
生理生化
半壽期：10-160h。
穩(wěn)定性：與溫度有很大關(guān)系，不管在什么溫度下保存均可導(dǎo)致酶失活。
分離純化
主要作用
同工酶
乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一類NAD依賴性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基，可構(gòu)成6種四聚體同工酶。動物乳酸脫氫酶是由4個亞單位組成的四聚體，是一個具有5種同工酶形態(tài)的分子，即常見的A、B兩種亞基構(gòu)成的5種LDH同工酶（LDH1～5）。C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。用電泳的方法可以將人和動物組織的LDH分離出5種LDH同工酶。
人血清中含有5種同工酶，按其組織來源來說，LD1和LD2主要來源于心肌，臨床常用的α-羧基丁酸脫氫酶（α-HBD）實際上就是LD1和LD2的活性之和；LD3主要來源于肺、脾；LD4和LD5（特別是LD5）主要來源于肝和骨骼肌。正常人血清中LD同工酶活性大小順序為：LD2>LD，>LD4>LD3，不少疾患不僅有LD總活性變化，而且由于病變的臟器不同，各個同工酶變化也不一致。
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