酶聯(lián)免疫試劑盒（酶聯(lián)免疫試劑盒）
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酶聯(lián)免疫試劑盒
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒） (以下簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒）) ：是酶免疫測定技術(shù)中應用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗）法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。
基本信息
| 中文名 | 酶聯(lián)免疫試劑盒 |
| 解釋 | 酶免疫測定技術(shù)中應用最廣的技術(shù) |
| 產(chǎn)品用途 | 科研試劑盒.提供實(shí)驗代測服務(wù). |
| 種類(lèi) | 主要有19種 |
種類(lèi)
Elisa 洗板
使用
標本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清
或血漿。每個(gè)標本量收集體積=100ul×檢測種類(lèi)。取材前須向銷(xiāo)售人員索要說(shuō)明書(shū)。
樣品采集：收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。對收集后當天進(jìn)行檢測的標本，儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，
將標本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復凍融。標本2-8℃可保存48小時(shí)，-20℃可保存1個(gè)月。-70度可保存6個(gè)月。部分
激素類(lèi)標本需添加抑肽酶。
臨床及科研樣品 ELISA 檢測服務(wù)
操作步驟、靈敏度、測范圍（RANGN）可以參照說(shuō)明書(shū)
產(chǎn)品用途: 科研ELISA檢測試劑盒。提供實(shí)驗代測服務(wù).
骨代謝,肝纖維化,腫瘤，激素內分泌、自身抗體科研ELISA檢測試劑盒
試劑盒
自從Engvall和Perlman（1971）首次報道建立ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）以來(lái)，由于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標準化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用。盡管早期的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)由于特異性不夠高而妨礙了其在實(shí)際中應用的步伐，但隨著(zhù)方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)試驗，都大大提高了ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀的使用，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。
試劑的性質(zhì)
(一) 基本原理 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結合，此種結合不會(huì )改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過(guò)底物的顏色反應來(lái)判定有無(wú)相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來(lái)，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
(二) 用于標記的酶 用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產(chǎn)物易于顯現；能商品化生產(chǎn)。目前應用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。
1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱(chēng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應時(shí)的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀(guān)察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時(shí)內不改變，是目前國內ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)中最常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類(lèi)很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。
(三) 抗體的酶標記方法及標記效果測定
1.標記方法 良好的酶結合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關(guān)重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標記效果好，特別適用于實(shí)驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過(guò)夜）使之結合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時(shí)，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析過(guò)夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測定后，冷凍干燥或低溫保存。
2.酶標抗體標記效果測定：測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線(xiàn)，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著(zhù)色，如果出現應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個(gè)測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
(2) 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進(jìn)行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產(chǎn)率=結合物中酶總量/標記時(shí)加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)的結合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達 1000(g/ml時(shí)效果最好。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時(shí)效果一般，1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)最好。酶結合率為 7%時(shí)效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時(shí)最好。(四) ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本類(lèi)型、用途及操作程序
試劑盒的類(lèi)型
根據ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)所用的固相載體而區分為三大類(lèi)型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)，即我們通常所指的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）；另一類(lèi)是用硝酸纖維膜為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒),稱(chēng)為斑點(diǎn)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）;再一類(lèi)是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)，稱(chēng)為布ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）。在微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)中，又根據其性質(zhì)不同分為間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)、雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)、雙夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)、競爭ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)、阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)及抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)。
吸附試驗
1.間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)為例，間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)的操作程序如下。
(1) 材料
③ ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。
(3) 結果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。
2.雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測大分子抗原。現以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
3.雙夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒) 此法與雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)的主要區別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為：
① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑥ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
④ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。5.阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測法為例介紹其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑦ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
本試驗同時(shí)設標準陰、陽(yáng)性血清對照、兔抗AP2型陽(yáng)性對照、空白對照。
6.抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)等幾種，其中以標記抗原捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)比較有代表性，該方法的主要程序為：
① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
7.斑點(diǎn)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）與常規的微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)比較，Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)具有簡(jiǎn)便、節省抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且結果可長(cháng)期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀(guān)，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：(1)載體膜的預處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽(yáng)性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點(diǎn)加40－53個(gè)樣品，每個(gè)壓圈可加抗原液1－20μl。
(2) 封閉 將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時(shí)間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶標抗體，37℃反應一定時(shí)間后，用洗滌液洗三次。
(5)顯色加入新鮮配制的底物液，37℃反應一定時(shí)間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
8.布ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)） C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Cloth-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)）是加拿大學(xué)者Blais, B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)類(lèi)似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗，酶聯(lián)免疫試劑盒)的主要程序為：
(2) 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；
(3) 加酶標記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；
(4) 加入底物液顯色；
吸附測定
1 標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過(guò)一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應注意無(wú)菌操作，也可加入適當防腐劑。
2 試劑的準備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準備實(shí)驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時(shí)放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時(shí)應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA中似不恰當。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著(zhù)水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時(shí)的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。
5 洗滌
洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻也決定著(zhù)實(shí)驗的成敗。ELSIA?是靠洗滌來(lái)達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過(guò)程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿(mǎn)板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿(mǎn)板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說(shuō)明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長(cháng)浸泡時(shí)間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
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