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酶聯(lián)免疫試劑盒
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒） (以下簡(jiǎn)稱ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）) ：是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。
基本信息
| 中文名 | 酶聯(lián)免疫試劑盒 |
| 解釋 | 酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù) |
| 產(chǎn)品用途 | 科研試劑盒.提供實(shí)驗(yàn)代測(cè)服務(wù). |
| 種類 | 主要有19種 |
種類
Elisa 洗板
使用
標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清
或血漿。每個(gè)標(biāo)本量收集體積=100ul×檢測(cè)種類。取材前須向銷售人員索要說(shuō)明書(shū)。
樣品采集：收集標(biāo)本前必須清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。對(duì)收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本，
將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8℃可保存48小時(shí)，-20℃可保存1個(gè)月。-70度可保存6個(gè)月。部分
激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。
臨床及科研樣品 ELISA 檢測(cè)服務(wù)
操作步驟、靈敏度、測(cè)范圍（RANGN）可以參照說(shuō)明書(shū)
產(chǎn)品用途: 科研ELISA檢測(cè)試劑盒。提供實(shí)驗(yàn)代測(cè)服務(wù).
骨代謝,肝纖維化,腫瘤，激素內(nèi)分泌、自身抗體科研ELISA檢測(cè)試劑盒
試劑盒
自從Engvall和Perlman（1971）首次報(bào)道建立ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）以來(lái)，由于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。盡管早期的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)由于特異性不夠高而妨礙了其在實(shí)際中應(yīng)用的步伐，但隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對(duì)某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)試驗(yàn)，都大大提高了ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀的使用，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。
試劑的性質(zhì)
(一) 基本原理 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。
(二) 用于標(biāo)記的酶 用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。
1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變，是目前國(guó)內(nèi)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)中最常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。
(三) 抗體的酶標(biāo)記方法及標(biāo)記效果測(cè)定
1.標(biāo)記方法 良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋簩?μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過(guò)夜）使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對(duì)之透析過(guò)夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。
2.酶標(biāo)抗體標(biāo)記效果測(cè)定：測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。
(2) 結(jié)合物的定量測(cè)定 一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計(jì)算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量
結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果最好。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般，1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)最好。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般，為9%－10%較好，達(dá)30%以上時(shí)最好。(四) ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本類型、用途及操作程序
試劑盒的類型
根據(jù)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)，即我們通常所指的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒),稱為斑點(diǎn)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）;再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)，稱為布ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）。在微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)、雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)、雙夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)、阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)及抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)。
吸附試驗(yàn)
1.間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)為例，間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)的操作程序如下。
(1) 材料
③ ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算出P/N比值。
(3) 結(jié)果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。
2.雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測(cè)大分子抗原。現(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
3.雙夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 此法與雙抗體夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)椋?/span>
① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑥ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
4.競(jìng)爭(zhēng)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)定。其基本程序?yàn)椋?/span>
① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
④ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。5.阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)法為例介紹其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑦ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。
6.抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒) 本法主要用于檢測(cè)IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測(cè)出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)比較有代表性，該方法的主要程序?yàn)椋?/span>
① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀測(cè)定OD值。
7.斑點(diǎn)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）與常規(guī)的微量板ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)比較，Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)具有簡(jiǎn)便、節(jié)省抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且結(jié)果可長(zhǎng)期保存；但其也有不足，主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序?yàn)椋?1)載體膜的預(yù)處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽(yáng)性抗原及被檢測(cè)抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點(diǎn)加40－53個(gè)樣品，每個(gè)壓圈可加抗原液1－20μl。
(2) 封閉 將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應(yīng)一定時(shí)間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)一定時(shí)間后，用洗滌液洗三次。
(5)顯色加入新鮮配制的底物液，37℃反應(yīng)一定時(shí)間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
(6) 結(jié)果判定 以陽(yáng)性、陰險(xiǎn)血清作為對(duì)照，膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。
8.布ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)） C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)（Cloth-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)）是加拿大學(xué)者Blais, B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應(yīng)提供較大的表面積，提高反應(yīng)的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)類似，只是載體不同。以對(duì)布氏桿菌抗原的檢測(cè)為例，C－ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)的主要程序?yàn)椋?/span>
(2) 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；
(3) 加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；
(4) 加入底物液顯色；
吸附測(cè)定
1 標(biāo)本的采取和保存
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。
血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。
ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為徹底，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
5 洗滌
洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA?是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過(guò)程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說(shuō)明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
吊白塊檢測(cè)試劑
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