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流式細胞儀
對細胞進(jìn)行分析和分選的裝置
流式細胞儀（Flow cytometry）是對細胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來(lái)。多數流式細胞計是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個(gè)細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說(shuō)，它的細節分辨率為零。
基本信息
| 中文名 | 流式細胞儀 |
| 定義 | 對細胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置 |
| 注意事項 | 特別強調每次測量都需要對照組 |
| 應用 | 分析細胞表面標志 |
| 組成 | 流動(dòng)室和液流系統 |
| 工作原理 | 參數測量原理 |
收起
基本結構
組成
光學(xué)系統
經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線(xiàn)最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(cháng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器，則可得到550～650nm連續可調的激光，尤在590nm處轉換效率最高，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì )聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(cháng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(cháng)，調整反射鏡的角度使調諧到所需要的波長(cháng)λ。為了進(jìn)一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(cháng)區段的光線(xiàn)濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(cháng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(cháng)以上的光線(xiàn)通過(guò)而將此波長(cháng)以下的另一特定波長(cháng)的光線(xiàn)反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測兩種以上的波長(cháng)的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)。
檢測系統
經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉換器轉變成電信號而進(jìn)行測量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應時(shí)間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200～900nm的光譜區，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續調節，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時(shí)特別要注意穩定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對光電管進(jìn)行暗適應處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類(lèi)放大器。一類(lèi)是輸出信號輻度與輸入信號成線(xiàn)性關(guān)系，稱(chēng)為線(xiàn)性放大器。線(xiàn)性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學(xué)線(xiàn)性過(guò)程的信號，例DNA測量等。另一類(lèi)是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數放大器。因為在免疫分析時(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強度相差1～2個(gè)數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器采集數據易于解釋。此外還有調節便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。
工作原理
下面分別簡(jiǎn)要介紹流式細胞儀有關(guān)的參數測量、樣品分選及數據處理等工作原理。
參數測量原理
流式細胞儀可同時(shí)進(jìn)行多參數測量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進(jìn)行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細胞通過(guò)測量區時(shí)，受到激光照射會(huì )向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線(xiàn)，散射光的波長(cháng)和入射光的波長(cháng)相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內部結構密切相關(guān)，因為這些生物學(xué)參數又和細胞對光線(xiàn)的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線(xiàn)都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過(guò)固定的和染色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線(xiàn)的立體角等非生物因素有關(guān)。
在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱(chēng)90角散射。這時(shí)所說(shuō)的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說(shuō)來(lái)，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著(zhù)細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實(shí)驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線(xiàn)性關(guān)系；對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來(lái)獲取有關(guān)細胞內部精細結構的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內較大顆粒給出靈敏反映。
在實(shí)際使用中，儀器首先要對光散射信號進(jìn)行測量。當光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長(cháng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數情況下會(huì )干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學(xué)等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體來(lái)說(shuō)，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說(shuō)來(lái)，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。
減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。
樣品分選原理
流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來(lái)完成的。總的過(guò)程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個(gè)參數由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類(lèi)型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。
穩定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數百μm。實(shí)驗經(jīng)驗公式f=v/4.5d給出形成穩定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì )改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數十ms。精確測定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數字電路來(lái)產(chǎn)生延遲。可根據具體要求予以適當調整。
（50）數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至于對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問(wèn)題而定。
①數據顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖、二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。
直方圖是一維數據用作最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線(xiàn)。根據選擇放大器類(lèi)型不同，坐標可以是線(xiàn)性標度或對數標度，用“道數”來(lái)表示，實(shí)質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強度。坐標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數與細胞之間的關(guān)系是它的局限性。
二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨立參數與細胞相對數之間的關(guān)系。坐標和坐標分別為與細胞有關(guān)的兩個(gè)獨立參數，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應坐標值的細胞存在（圖10-3）。可以由二維點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說(shuō)多個(gè)細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現為一個(gè)點(diǎn)，這樣對細胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細結構。
流式細胞儀
二維等高圖類(lèi)似于地圖上的等高線(xiàn)表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續曲線(xiàn)上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線(xiàn)層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線(xiàn)越密集則表示變化率越大，等高線(xiàn)越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。
假三維圖是利用計算機技術(shù)對二維等高圖的一種視覺(jué)直觀(guān)的表現方法。它把原二維圖中的隱坐標—細胞數同時(shí)顯現，但參數維圖可以通過(guò)旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀(guān)察“山峰”和“谷地”的結構和細節，這無(wú)疑是有助于對數據進(jìn)行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。
圖10-4二維等高圖圖10-5假三維圖
列表模式其實(shí)只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個(gè)以上的參數數據顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來(lái)完成的。可用ListMode中的特殊技術(shù)，開(kāi)窗或用游標調出相關(guān)部分再改變維數進(jìn)行顯示。例如，“一調二”就是在一維圖上調出二維圖來(lái)；“二調一”就是從二維圖中調出一維圖來(lái)。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。
流式細胞儀
上面簡(jiǎn)要地介紹了幾種數據顯示形式，在實(shí)際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數據分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類(lèi)。當被檢測的生物學(xué)系統能夠用某種數學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數方法。數學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數產(chǎn)生所需要的信息來(lái)自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數來(lái)描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標準偏差。方程的數據擬合則通常使用最小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設，即采用無(wú)設定參數分析法。分析程序可以很簡(jiǎn)單，只需要直觀(guān)觀(guān)測頻數分布；也可能很復雜，要對兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。
逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統）是大家常用的數據分析的重要手段。我們常可以用來(lái)了解數據的特性、尋找那些不曾預料的特異征兆、選擇統計分析的模型、顯示最終結果等。事實(shí)上，不經(jīng)過(guò)先對數據進(jìn)行直觀(guān)觀(guān)察分析就決不應該對這批數據進(jìn)行數值分析。從這一點(diǎn)來(lái)看，非參數分析是參數分析的基礎。
逐道比較工作量較大，但用直觀(guān)法很容易發(fā)現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時(shí)刻對照組等，具體設置應根據整體實(shí)驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對曲線(xiàn)的總細胞數進(jìn)行歸一化處理，甚至對兩條曲線(xiàn)逐道相減而得到“差結果曲線(xiàn)”往往是適宜的。
因為數據分析往往和結果解釋關(guān)系十分密切，也就是說(shuō)和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結合實(shí)例再介紹。
技術(shù)參數
指標
為了表征儀器性能，往往根據使用目的和要求而提出幾個(gè)技術(shù)參數或指標來(lái)定量說(shuō)明。對于流式細胞儀常用的技術(shù)指標有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數等。
熒光分辨率
C.V=σ/μ
式中，σ為標準偏差，μ是平均值。
在實(shí)際應用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。現在市場(chǎng)上儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。
熒光靈敏度
反映儀器所能探測的最小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate異硫氰基熒光素）的最少分子數來(lái)表示。現在市場(chǎng)使用儀器均可達到1000左右。
分選速度
儀器每秒種可分析/分選的數目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。
樣品濃度
主要給出儀器工作時(shí)樣品濃度的適用范圍。一般在1010細胞/ml的數量級。
其它技術(shù)參數尚多，不再一一介紹。
調試和使用
簡(jiǎn)介
古語(yǔ)說(shuō)：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應用流式細胞分析和分選技術(shù)，必需先對儀器進(jìn)行調試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡(jiǎn)要介紹細胞計的調試項目及要點(diǎn)、使用的程序等等。
調試和校準
流式細胞儀在使用前，甚至在使用過(guò)程中都要精心進(jìn)行調試，以保證工作的可靠性和最佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區的光路等。
激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長(cháng)的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線(xiàn)使激光的強度輸出為最大。
液流速度：可通過(guò)操作臺數字顯示監督，調節氣體壓力大小以獲得穩定的液流速度。
流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統進(jìn)行校準或標定，這樣才能通過(guò)相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標準樣品應該穩定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學(xué)標準樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標準樣品。微球用樹(shù)脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過(guò)程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
操作和使用
①打開(kāi)電源，對系統進(jìn)行預熱；
②打開(kāi)氣體閾，調節壓力，獲得適宜的液流速度；開(kāi)啟光源冷卻系統；
⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時(shí)選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀(guān)掌握測量進(jìn)程；
⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統；
⑧將所需結果打印出來(lái)。
注意事項
2）光源不得在短時(shí)間內（一般要1h左右）關(guān)上又打開(kāi)；使用光源必須預熱并注意冷卻系統工作是否正常；
3）液流系統必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒；
4）注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類(lèi)型等；
5）特別強度每次測量都需要對照組。
應用
液體活檢
包括NGS、ddPCR、CTC，還有ctDNA等。
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