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免疫熒光
特異性強、敏感性高的標記技術(shù)
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進(jìn)行組織或細胞內抗原物質(zhì)的定位。
技術(shù)特點(diǎn)
該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決，結果判定的客觀(guān)性不足，技術(shù)程序也還比較復雜。
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類(lèi)，并且還有專(zhuān)供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。
原理
免疫學(xué)的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
直接法
將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進(jìn)行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
技術(shù)分類(lèi)
⑴熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù)）
抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。
⑵免疫熒光測定技術(shù)
抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法
⑴熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(cháng)為490~495nm，最大發(fā)射光波長(cháng)520~530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：
有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質(zhì)結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。
⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩定，可長(cháng)期保存。結構式如下：
最大吸收光波長(cháng)為570nm，最大發(fā)射光波長(cháng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。
⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：
最大吸引光波長(cháng)為550nm，最大發(fā)射光波長(cháng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結合，但熒光效率較低。
⑵其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(cháng)為360nm，發(fā)射光波長(cháng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
常見(jiàn)熒光素
1)FITC
2)RB200
3)TRITC
4）鑭系：Eu、Tb
5)PE
6）其它
實(shí)驗步驟
直接法測抗原
⑴基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實(shí)驗步驟
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。
② 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全復蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀(guān)察。觀(guān)察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無(wú)熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見(jiàn)；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽(yáng)性。
⑷注意事項
1）對熒光標記的抗體的稀釋?zhuān)ＷC抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過(guò)1：20，抗體濃度過(guò)低，會(huì )導致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結果的觀(guān)察。
2）染色的溫度和時(shí)間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長(cháng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較37℃30 min效果好的多。
3）為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時(shí)需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。
如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。
4）一般標本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現象，經(jīng)熒光染色的標本最好在當天觀(guān)察，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)，熒光強度會(huì )逐漸下降。
間接法測抗體
⑴基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會(huì )和已結合抗原的抗體進(jìn)一步結合，從而可鑒定未知抗體。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋。
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實(shí)驗步驟
1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。
2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，復蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。
4）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
6）重復操作3。
7）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再復以蓋玻片。
8）熒光顯微鏡高倍視野下觀(guān)察，結果判定同直接法。
⑷注意事項
1）熒光染色后一般在1h內完成觀(guān)察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(cháng)，會(huì )使熒光減弱。
2）每次試驗時(shí)，需設置以下三種對照：
① 陽(yáng)性對照：陽(yáng)性血清+熒光標記物
③ 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
免疫熒光
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尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
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