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硝酸纖維素膜NC膜
用于生物學(xué)試驗的材料
硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)，在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。NC膜是生物學(xué)試驗中最重要的耗材之一。
基本信息
| 中文名 | 硝酸纖維素膜NC膜 |
| 外文名 | nitrocellulose filter membrane |
| 原理 | 勻漿配比 |
| 供應(yīng)商 | PALL(美國) |
生產(chǎn)原理
滾筒鋪膜
配好的勻漿通過滾筒，形成了一張薄膜，平攤在十分光滑的平面載體上。過程與造紙非常相似。
成型
當(dāng)勻漿內(nèi)的成型劑開始揮發(fā)，膜逐步干燥成型。同時在這個過程中由于溫度比較高，有些廠家在這個過程采取了在密閉腔體內(nèi)成型，同時補充配方溶液的形式，來避免一些有效成分的蒸發(fā)。
切割
通過以上步驟生產(chǎn)出來的膜是呈一個寬度極大的產(chǎn)品，寬度的大小直接和滾筒的大小相關(guān)，滾筒越大生產(chǎn)越方便，但設(shè)備的成本也越高。寬膜要經(jīng)過切割才能成為我們購買到的25mm或18mm（或20mm）寬的膜，而長度上，成品卷膜和寬膜的長度是相同的。理論上可以讓廠家切成你需要的任意寬度，但這樣會造成原料的浪費和人力成本的增加，后來廠商在和試紙生產(chǎn)廠家的協(xié)調(diào)過程中，綜合用料成本和生產(chǎn)便利性基本確定了上面說的寬度，以此為標(biāo)準(zhǔn)。
從生產(chǎn)過程，我們可以得知，NC膜本身已經(jīng)添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經(jīng)存在有一定的緩沖系統(tǒng)（雖然對紙條測試影響不會很大）。
供應(yīng)商
現(xiàn)在有銷售的NC膜品牌型號如下：
PALL(美國)
MILLIPORE（美國），M135（有背襯/無背襯兩種） M180（有背襯/無背襯兩種）
WHATMAN and SS，Puraband impuraband
SARTORIUS（德國），CN140
伊能（國產(chǎn)），8um 6um
泰滋德 TEST（國產(chǎn)）8um 6um
MDI（印度），8um 6um
說到這些供應(yīng)商，不得不談?wù)劙l(fā)展的歷史. SS是膜行業(yè)的鼻祖，這點所有的膜公司都承認(rèn)。millipore，SARTORIUS和whatman都是后輩，由于SS在市場競爭的過程中經(jīng)營方式落后，最后被whatman收購。就產(chǎn)品質(zhì)量來說SS的AE99和AE98是非常優(yōu)良的。
而MDI是近年才出現(xiàn)的一個膜公司，可能與印度膠體金試紙生產(chǎn)行業(yè)的快速發(fā)展密切相關(guān)，其所有的產(chǎn)品都是在印度生產(chǎn)，經(jīng)營者為父子兩人，父親負(fù)責(zé)技術(shù)，兒子進(jìn)行經(jīng)營。
國產(chǎn)膜伊能主要特點成本較低，性能與一些進(jìn)口膜很接近，經(jīng)過一些有針對性的優(yōu)化后可以用在HCG產(chǎn)品的生產(chǎn)。但不是所有的工廠都能購輕易的完成這個優(yōu)化工作。膜的國產(chǎn)化是一個趨勢，但進(jìn)口廠家要實現(xiàn)國產(chǎn)化還面臨很大的問題，其中廠房設(shè)備的搬遷就是一個非常大的問題。
幾家供應(yīng)商的國內(nèi)聯(lián)絡(luò)人和技術(shù)支持分別是
PALL（美國），Mr Xiaoliang Tang, Dong Wang
MILLIPORE（美國），Mrs Yang，harry
WHATMAN and SS，Clark，kevin
SARTORIUS（德國），Mr Xu，Iric
伊能（國產(chǎn)），connie，Mr Yang
泰滋德 TEST（國產(chǎn)）Mr li
MDI（印度），Ashawant Gupta
銷售模式都是直銷式，少量購買需通過代理商購買。價格上PALL、MILLIPORE與WHATMAN相當(dāng)，SARTORIUS便宜一些，國產(chǎn)膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS價格相同。在科研市場，PALL、MILLIPORE使用最多。生產(chǎn)客戶中，MILLIPORE，HATMAN，SARTORIUS占有量相當(dāng)，伊能現(xiàn)在也開始有一些工廠客戶了，MDI量最小投訴也最多。
膜的選擇
以上談了該行業(yè)的一些發(fā)展現(xiàn)狀，那么我們大致了解后，回到最關(guān)心的問題，如何選擇膜？經(jīng)常會遇到的問題是，我是做**項目的，我該選擇那類膜？
這里涉及到一個膜的分類標(biāo)準(zhǔn)問題，一個供應(yīng)商可能提供這個膜是8um，但另一個供應(yīng)商告訴你膜是135s的。這之間的區(qū)別與聯(lián)系是什么？
um指的是膜孔徑，而從上面膜的生產(chǎn)過程，我們可以看出，膜的孔徑實際上是沒有辦法界定的。由于干燥成型等過程的非絕對均一，膜的孔徑也是非均一的。膜孔徑的說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼。而以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是***s.該單位已經(jīng)越來越被各大廠商所接受，成為了一個通用的比較標(biāo)準(zhǔn)。以下我們將采用s單位來進(jìn)行交流。
換算情況大致為：8um=135s；6um=180s
不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)有什么影響呢？
首先，我們分析一下液體在膜上的運動過程。一張長度為4cm的膜，每隔1cm做一個標(biāo)記，當(dāng)液體運動過標(biāo)記處時記錄時間點. 那么你將會發(fā)現(xiàn)液體在膜上的運動是呈減速前行的。而兩張不同秒數(shù)的膜（例如135s， 180s）在同一時間標(biāo)記點處的運動速度不同。這個試驗用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。
那么從這個試驗可以看出，在通過同一T線噴點位置時，金溶液通過的速度是快速膜>慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。
其實我們并沒有那么多選擇。經(jīng)過使用實踐，各供應(yīng)商一般都只提供兩個型號，就是135s和180s。雖然看到有些廠家的產(chǎn)品目錄上型號種類繁多，但這兩個型號的定貨量就占了95%以上，其他型號供貨上也就遠(yuǎn)不如這兩個型號來得順利。135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. 你所要做的是，先選擇其中的一個型號，然后比較不同供應(yīng)商同一個型號的差異，由于前面說的添加配方與你的試驗條件配合的不同，這個差異可能大也可能小。具體要根據(jù)試驗結(jié)果來確定最后的選擇。我個人不建議地毯式的測試不同規(guī)格/不同廠家的膜，這樣成本高，成功的幾率也小。
質(zhì)控方式
本節(jié)適合用膜量較大的公司用戶參考。對于一卷膜可以用上幾個月的用戶來說，廠家的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)完全能滿足你的要求，而不需要自己再做相關(guān)的質(zhì)控。
膜的質(zhì)控雖屬于原輔料QC職能，但由于其專業(yè)性強，一般都由小樣調(diào)試人員來執(zhí)行。膜入原料庫后需要進(jìn)行如下檢驗工作：
1. 查收COA
在購買時，供應(yīng)商會隨產(chǎn)品為每個lot的膜提供一張紙質(zhì)的出廠質(zhì)量證書，該證書被稱為COA。如果你已經(jīng)購買某一批次的膜，而沒有索取相應(yīng)的證書，如果有需要可提供批號向廠家要求補發(fā)。其實在很多行業(yè)都有廠商為自己的產(chǎn)品附上COA的習(xí)慣。
COA一般只提供給大客戶，對小客戶是沒有意義的。其內(nèi)容主要是廠家在產(chǎn)品出廠時做過一些測試的羅列。作用可以理解為質(zhì)量憑證和測試數(shù)據(jù)參考。
2. 檢查物理性能
膜的物理性能主要是2個參數(shù)，膜厚度和寬度。長度不需要檢測。使用中可以關(guān)注長度上是否有斷面重接現(xiàn)象，斷面多費料則多，少數(shù)發(fā)生。厚度，由螺旋測微尺，選擇幾個測量點檢測后算平均。膜生產(chǎn)的必測參數(shù)。主要表現(xiàn)為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速。寬度，普通直尺測量。物理性能一般都不會有什么大問題。畢竟檢測標(biāo)準(zhǔn)客觀，易把握。沒有條件執(zhí)行的廠家可省略。
3. 跑水性能
樣本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易觀測，需制作一個簡易支架。
操作：注入足夠溶液到下部槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長大于4cm）并放到傾斜支架，整個支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計時。記錄每個標(biāo)記處的通過時刻，并與對照組比較。跑板時，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反?，F(xiàn)象。
4. 點樣測試
C/T線出線時間，其他試驗條件相同情況下，記錄和比較C/T線出現(xiàn)時間是否與對照有差異。
靈敏度，比較不同樣本濃度情況下，T線的變化是否和對照組同。一般每批次膜取前端一段用來測試即可。由于制造過程的不均一性，不同批號的靈敏度會有一定差異，當(dāng)大批量使用時，這種差異影響是非常大的，那么就要按照靈敏度表現(xiàn)將不同批號的膜進(jìn)行分類。在膜的STOCK中要能夠輕易的分辨出來。當(dāng)進(jìn)入后期生產(chǎn)調(diào)用時，就能根據(jù)這些分類，按照訂單要求取用不同批號的膜，或者用強靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配。
關(guān)于膜的批內(nèi)差。批內(nèi)差是肯定存在的，只是差距大小的問題，依據(jù)一般的測試條件是很困難獲得詳細(xì)的數(shù)值，因為你不可能對每一卷膜的每一段都做詳細(xì)的測試。減小膜批內(nèi)差的最有效方法是不購入邊緣膜帶。前面說過膜的生產(chǎn)方式，生產(chǎn)出的半成品是寬幅很大的一個膜面，要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度。那么就有中間部分，和邊緣部分之分。越靠近中間部分，膜的均勻性越好，邊緣部分則相對要差，就造成了批內(nèi)差。一般可以通過COA獲得具體位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置。
如果是試用某個型號的膜小樣，還需要在以上檢測后加入膜加速老化試驗，包括膜單獨的老化試驗和點好膜后產(chǎn)品的老化試驗，具體試驗方法請參看我以前寫的研發(fā)思路一文。
應(yīng)用技巧
從本節(jié)開始，我們開始對膜進(jìn)行深入討論和談一些應(yīng)用技巧。
1. 蛋白與膜的結(jié)合原理
兩條假說，都表明其結(jié)合過程分為兩步，首先結(jié)合和后面長時間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗。
2. 膜對結(jié)合的影響
1）膜孔徑
有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜，但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產(chǎn)品，如果是不同廠家的產(chǎn)品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關(guān)系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那么金標(biāo)復(fù)合物通過T線的時間也就越長，反應(yīng)也就越充分。
綜合以上兩點，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機會，也就是假陽性越高。所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
這個差異主要來源于兩點：
1> 生產(chǎn)膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數(shù)量不同。同理，在膜處理中這兩類物質(zhì)一般會對性能產(chǎn)生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方
1）生物原料，作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體，主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結(jié)合條件都有細(xì)微的差別，毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結(jié)合到固相材料上。
2）緩沖液
大家最關(guān)心的可能就是希望獲得一個性能優(yōu)良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應(yīng)體系需要不同的配方來支持，而不同機構(gòu)的反應(yīng)體系又有差異。想獲”魚”先學(xué)”漁”.。為了不誤導(dǎo)大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩沖液的構(gòu)成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質(zhì)（針對某一特定問題）+PH調(diào)整. 我在參考過以前的各種資料后，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據(jù)自己的需要添加作用物質(zhì)，原來的很多需要添加的作用物質(zhì)，由于膜制造技術(shù)的改進(jìn)已經(jīng)不再需要。
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2，該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應(yīng)性。
作用物質(zhì)的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少信號強度，消假陽。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現(xiàn)象，也可增色。
糖，保護(hù)劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調(diào)PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環(huán)境
環(huán)境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現(xiàn)散點，導(dǎo)致測試會出現(xiàn)疏水斑。濕度過高，膜上毛細(xì)作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴(kuò)散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關(guān)系
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式。非接觸點膜式優(yōu)于劃膜式，進(jìn)口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆，劃管會在其表面留下印痕。進(jìn)口的劃膜機由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好，所以留下的劃痕較輕，而國產(chǎn)儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴(yán)重。劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力，導(dǎo)致假陽性。同時容易出現(xiàn)跑板時在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細(xì)線（鬼線），而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種，分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標(biāo)復(fù)合物通過T線位置時速度變慢，反應(yīng)時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴(kuò)散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴(kuò)散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當(dāng)干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴(kuò)散，所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發(fā)現(xiàn)線條出現(xiàn)兩端紅，中間淡的現(xiàn)象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質(zhì)來解決。
8. 點膜前后的封閉作用
從供應(yīng)商處購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的，直接點膜就可使用。然而我們還是經(jīng)常會遇到關(guān)于封閉的討論。其實封閉不象大家認(rèn)為的那樣，一封閉什么問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產(chǎn)膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內(nèi)，必然擾亂了膜內(nèi)正常的物質(zhì)分布。由此引發(fā)了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經(jīng)常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質(zhì)處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質(zhì)配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復(fù)活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產(chǎn)品的穩(wěn)定性造成影響，具體的影響程度要通過穩(wěn)定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產(chǎn)出的膜一般含有5-10%的水分。關(guān)于膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認(rèn)為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發(fā)，使膜變得疏水，帶電荷并變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據(jù)具體試驗情況來判斷了。有些膜由于生產(chǎn)工藝的問題，使用后靈敏度會在一段時間內(nèi)發(fā)生變化，遇到這種問題，就需要在點膜后放置一段時間，待穩(wěn)定后方可進(jìn)入調(diào)試生產(chǎn)。
硝酸纖維素膜NC膜
規(guī)格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存，保質(zhì)期一年
產(chǎn)品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應(yīng)立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結(jié)構(gòu)皆視為次品。用于轉(zhuǎn)移電泳，宜選孔經(jīng)0.22或0.45，以保證膜的強度，并減少穿透損失，硝纖膜過份干燥時脆，濕時有彈性，操作時室內(nèi)應(yīng)保持中常溫度，避免過份干燥，防止發(fā)脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉(zhuǎn)膜的蛋白集中而不擴(kuò)散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。
應(yīng)用舉例
1.分子雜交
雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。
固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號的檢測。
用探針對細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。某特點是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)。例如?？捎锰禺愋缘募?xì)菌、病毒的核酸做為探針對組織、細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨特的意義。下面以放射性標(biāo)記探針與固定在NC膜上的核酸進(jìn)行雜交為例，雜交反應(yīng)操作如下：
① 配制所需試劑
② 將含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤，并繼續(xù)浸泡2分鐘。
③ 將濕潤NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預(yù)雜交液，盡可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時或過夜。
④ 將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即于100℃加熱5分鐘，然后立即置冰浴使驟冷。
⑤ 從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，盡可能將袋內(nèi)空氣擠出去，重新封口，并將雜交袋裝入另一個干凈的袋內(nèi)，封閉，以防放射性污染。
⑥ 將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時。
⑦ 取出雜交袋，剪開，取出濾膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS中，室溫振蕩5分鐘，勿使濾膜干燥。
⑧ 將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鐘。
⑨ 將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鐘至1小時。
⑩ 將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鐘至1小時。
⑾ 取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然后置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號的檢測。
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作者
