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融合蛋白
融合蛋白(fusion protein)有兩種不同的含義，一種是通過(guò)DNA重組技術(shù)得到的兩個(gè)基因重組后的表達產(chǎn)物。另一種含義就是介導兩個(gè)細胞質(zhì)膜融合的一組蛋白，如在仙臺病毒脂雙層外側小葉中含有的兩種糖蛋白之一，介導病毒被膜與宿主細胞質(zhì)膜的融合作用。另一種糖蛋白是血細胞凝集素神經(jīng)酰胺酶。兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)連成一個(gè)大分子。可以通過(guò)化學(xué)方法連接，也可以通過(guò)基因的融合來(lái)實(shí)現。
基本信息
| 中文名 | 融合蛋白 |
| 外文名 | fusion protein |
| 常見(jiàn)種類(lèi) | 免疫球蛋白（Ig）融合蛋白 |
| 連接方式 | 化學(xué)方法和基因融合 |
內容簡(jiǎn)介
技術(shù)特點(diǎn)
技術(shù)內容
基于重復結構的融合蛋白大多為短肽，不具有復雜的空間結構，因此只需簡(jiǎn)單的多肽合成過(guò)程即可獲得目標蛋白。由單個(gè)氨基酸合成多肽主要通過(guò)兩個(gè)氨基酸之間脫水形成肽鍵來(lái)實(shí)現，主要包括以下基本步驟:：首先對兩性離子結構的氨基酸進(jìn)行相應的氨基或羧基保護，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過(guò)程結束后，對肽鏈上氨基酸的保護基團選擇相應的方式進(jìn)行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配制成溶液，并對其中一個(gè)氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不參與反應的側鏈基團進(jìn)行化學(xué)基團保護，只活化參加反應的氨基酸的羧基，待耦合反應完成后再將沒(méi)有參加反應的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產(chǎn)物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標產(chǎn)物純度高的優(yōu)勢。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)酯化反應固定于不溶性的樹(shù)脂上，進(jìn)而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護基團并同過(guò)量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重復脫保護、縮合、洗滌過(guò)程持續合成，獲得所需的肽鏈。合成完成后，再試用三氟乙酸將產(chǎn)物從樹(shù)脂上切割下來(lái)，同時(shí)脫除所有保護基團，純化回收獲得所需多肽。
相對來(lái)說(shuō)，具有一定空間結構且序列復雜的其他兩種融合蛋白的合成過(guò)程則復雜得多。精確構建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩定性的基礎。在獲得目標DNA序列后，將其連接進(jìn)入特定的載體之中，以獲得充足融合蛋白質(zhì)粒。由于遺傳基因的簡(jiǎn)并性，同一種融合蛋白可對應著(zhù)多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴增時(shí)選取的宿主種類(lèi)有關(guān)(大腸桿菌、酵母菌及真核細胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出現在需要使用大腸桿菌表達體系的質(zhì)粒中便會(huì )大大影響蛋白產(chǎn)率。重組質(zhì)粒中密碼子的優(yōu)化還有許多影響因素，密碼子偏倚、tRNA可用性、mRNA穩定性和mRNA結構都在基因表達中起重要作用，而且選擇DNA片段時(shí)也應盡量避免在重組基因載體中存在高度重復的部分以避免發(fā)生錯配，影響mRNA轉錄。
1.進(jìn)行目的基因的克隆：根據基因序列互補原則，設計合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增不同的目的DNA片段。
2.在載體中進(jìn)行重組：通過(guò)限制內切酶將兩個(gè)DNA片段進(jìn)行酶切并回收，然后通過(guò)連接酶將兩個(gè)具有相同末端酶切位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外連接，并克隆到高表達質(zhì)粒載體中，構建重組質(zhì)粒。
4.融合基因的誘導表達及表達蛋白的純化。
操作要點(diǎn)
在構建融合蛋白中，一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長(cháng)度對蛋白質(zhì)的折疊和穩定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長(cháng)，又涉及免疫原性的問(wèn)題，因為接頭序列本身就是新的抗原。
一般來(lái)說(shuō)，3-5個(gè)氨基酸的Linker可滿(mǎn)足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長(cháng)肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開(kāi)，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿(mǎn)意的結果。但具體涉及到每種蛋白時(shí)，需具體分析。當我們構建融合蛋白時(shí)，應多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質(zhì)的功能結構域是十分重要的。
遺憾的是，目前對于連接肽序列的設計還沒(méi)有可靠的選擇標準。現在，大多數連接肽序列的設計和選擇仍主要依賴(lài)于直覺(jué)。盡管依賴(lài)于蛋白質(zhì)的一級結構來(lái)預測其二級結構已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進(jìn)步，但是我們對于序列和結構之間的關(guān)系的了解還是很有限的。
結構設計
構建融合蛋白的基本方法是將具有特定功能的天然或人工編碼的多肽序列模塊化，并使用基因編碼的DNA序列模板合成，隨后將第1個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第2個(gè)蛋白基因，以實(shí)現兩個(gè)基因的共同表達。通過(guò)控制每一個(gè)功能肽模塊在整體蛋白材料中的確切位置和密度，人們便能夠根據實(shí)際需要改變融合蛋白的組成。
融合蛋白的設計大致分為基于重復結構、基于生長(cháng)因子以及基于細胞粘附分子3類(lèi)。第1類(lèi)融合蛋白中最典型的是來(lái)源于彈性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及絲素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs) 的融合蛋白。ELPs是一種由數個(gè)重復的氨基酸序列組成的細胞外基質(zhì)蛋白，由兩種短肽段交替排列構成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5種。最著(zhù)名的當屬VPGZG融合蛋白(Z可換為除了脯氨酸外任意氨基酸)。重復的VPGVG序列能夠使融合蛋白具有溫敏特性，將溫敏性ELP與化學(xué)、酶、物理等多種交聯(lián)方式的水凝膠結合起來(lái)能夠衍生出多種應用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，極易形成反向平行的β－折疊片層結構，具有多樣側鏈化學(xué)修飾位點(diǎn)，良好的熱穩定性和機械性能，在生物醫學(xué)上常用作手術(shù)縫合線(xiàn)，人工皮膚及軟骨修復材料。對于此類(lèi)融合蛋白，只需通過(guò)調節其氨基酸序列和分子鏈長(cháng)度，便能夠精確控制其對溫度、pH、離子強度的響應敏感性，從而實(shí)現可逆的溶解轉變。
臨床應用
1、DNA疫苗
目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來(lái)激活機體免疫系統；第二代疫苗是用生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)研制的組分疫苗注射機體誘導免疫應答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來(lái)激活人體免疫系統，即DNA疫苗。
DNA疫苗與傳統疫苗相比有著(zhù)明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩定性強，成本低廉等，并可同時(shí)誘導體液與細胞免疫應答。
目前利用基因工程成功制成的多價(jià)重組抗體融合蛋白CYF196(國內尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強的防御功能。
2、雙功能酶（多功能酶）
并且發(fā)現在這些新構建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個(gè)酶的活性部位均未受到影響，與單個(gè)酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續反應的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應”（proximity effect）。
目前研究發(fā)現，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應產(chǎn)生NADH的速度是同時(shí)加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時(shí)過(guò)渡態(tài)時(shí)間縮短近四倍。
3、定向藥物
定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過(guò)融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在一起，即可構成一個(gè)具有獨特構象與功能的蛋白質(zhì)。
4、基因表達
基因融合技術(shù)最早即是被用來(lái)在細菌（主要是大腸桿菌）中表達外源蛋白，如somatostatin4、insulin5等，對于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表達的方法在大腸桿菌中表達有很多優(yōu)點(diǎn)，一是由于外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的C端編碼序列之后，因此不需另外設計SD序列，同時(shí)，N端融合基因的存在，使得外源基因的表達相對比較容易。其二是外源基因的表達產(chǎn)物常常會(huì )被宿主細胞的蛋白酶所降解，當外源基因與宿主本身的某種蛋白如β-半乳糖苷酶的部分編碼序列構成融合基因，以融合蛋白的形式表達時(shí)，往往會(huì )減低宿主細胞對產(chǎn)物的降解。
常見(jiàn)的幾種
免疫球蛋白（Ig）融合蛋白
免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細胞中表達出的具有上述兩部分結構域的重組蛋白。據目的蛋白與Ig不同片段相連，可將其分為二大類(lèi)：一類(lèi)為Fab(Fv)融合蛋白；另一類(lèi)為Fc融合蛋白。
甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白
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細胞因子重組融合蛋白
細胞因子重組融合蛋白是一類(lèi)利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達相應蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物。其結構特點(diǎn)為將細胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發(fā)揮協(xié)同作用，使融合蛋白的生物學(xué)活性較各單體大大增強。
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