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防御素
富含二硫鍵的陽離子型多肽
基本信息
| 中文名 | 防御素 |
| 外文名 | Defensin |
| 活性 | 免疫調(diào)控，抗菌 |
| 分布 | 真菌 、植物與動物 |
| 二級結(jié)構(gòu) | αβ/全β |
防御素介紹
天然的防御素分布在從植物、低等動物到哺乳動物等幾乎所有的生物類群中，是生物長期與疾病斗爭中進化而來的，也是其自身防御體系的重要組成部分。大部分防御素和其他蛋白質(zhì)類物質(zhì)一樣，由基因直接編碼，可通過基因工程技術(shù)開發(fā)生產(chǎn)。
研究背景
1966年，美國科學(xué)家Zeya和Spitznagel首次在哺乳動物老鼠和豚鼠的多形核嗜中性白細胞中發(fā)現(xiàn)一類具有抗菌活性的堿性多肽，將其稱之為“溶酶體陽離子蛋白”。這就是后來人們稱之為防御素的物質(zhì)。到目前，人們已經(jīng)鑒定了四百余種防御素。
1985年，美國加州大學(xué)Robert Lehrer博士首次命名防御素（defensins），并報道了兔防御素MCP-1 及MCP-2對流感病毒和單純皰疹病毒具有直接中和滅活作用。次年，該研究組還報道了人體內(nèi)三種alpha防御素 (Humanα-defensin或human neutrophil peptide, HNP)對流感病毒、巨細胞病毒、水泡性口炎病毒等均有中和作用。
2002年，美國洛克菲勒大學(xué)艾倫·戴蒙德艾滋病研究中心的華人科學(xué)家張林琦在《SCIENCE》雜志上發(fā)表文章，報道人體內(nèi)抑制艾滋病病毒復(fù)制的物質(zhì)是T淋巴細胞分泌的α-防御素，這個發(fā)現(xiàn)為艾滋病的控制與治療提供了新的思路與方向，引起生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。
2003年開始，和仕康公司的核心研發(fā)人員在構(gòu)建海洋生物海馬等物種的cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)了大量防御素基因，并分離到五種天然防御素。2007年開始，他們依托南海海洋生物技術(shù)國家工程中心等科研轉(zhuǎn)化平臺將防御素發(fā)酵制劑作為飼料添加劑進行大量動物實驗，結(jié)果表明該制劑可顯著提升動物免疫力和防病抗病水平。
防御素的分類
（一）哺乳動物類防御素
防御素是動物體內(nèi)防御系統(tǒng)的主要成分，大多由29～42個氨基酸殘基組成，含3對分子內(nèi)二硫鍵，相對分子質(zhì)量為2～6ku,根據(jù)其二硫鍵位置的不同可分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素3類。
α-防御素是于1980年美國Lehrer實驗室從兔肺巨噬細胞中首先分離得到的、陽離子性極強的小分子抗菌肽，稱為defensin,后被歸為α-防御素；主要分布于人、兔、豬、鼠類的嗜中性粒細胞、兔子的齒槽巨嗜細胞及人類和嚙齒動物的小腸潘氏細胞。α-防御素分子鏈內(nèi)二硫鍵的連接位置分別為Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。其中Cys1-Cys6連接N端和C端，形成分子大環(huán)。
β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的氣管黏膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的，后又在牛粒性白細胞中發(fā)現(xiàn)了13 種與其序列高度相似, 但其共有序與α-防御素不同，故被命名為β-防御素；主要分布于牛的骨髓和人及多種動物(牛、羊、豬、駱駝、馴鹿、小鼠、大鼠)的胃腸道、呼吸道、舌、牙齦、腎、皮膚的上皮中，近來在梅花鹿舌粘膜的上皮細胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了該短肽。單核細胞和巨噬細胞通常缺乏防御素，但是他們可以釋放誘導(dǎo)上皮細胞合成β-防御素的信使。β-防御素分子鏈內(nèi)二硫鍵的連接位置分別為Cys1-Cys5、Cys2- Cys4、Cys3-Cys6。
θ-防御素是于2002年Trabi等用反向高效液相層析色譜法從獼猴的白細胞中分離出來的1種成環(huán)狀結(jié)構(gòu)分子，又被稱為獼猴θ型防御素-1(RTD-1),主要分布于巨嗜細胞內(nèi)。θ-防御素的結(jié)構(gòu)不同于α和β-防御素，其前體(已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種)是α-防御素類似物，由1個終止密碼子從α-防御素3個半胱氨酸碳骨架的第4個殘基處截斷，從截短的α-防御素前體切掉1個 9個氨基酸 的片段，然后從頭到尾進行剪切，直到其他的相同或相似的九肽出現(xiàn)。成熟的θ-防御素是2個半防御素的修飾與結(jié)合的產(chǎn)物，它的前體(稱之為半防御素)是變異的α-防御素基因和1個未成熟的終止密碼子的編碼產(chǎn)物，導(dǎo)致每1個前體僅僅包含3個半胱氨酸殘基。θ-防御素分子鏈內(nèi)二硫鍵的連接位置分別為Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6,連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
（二）昆蟲類防御素
在1988年由Masturyama在1種半翅目昆蟲肉蠅中發(fā)現(xiàn)了第1 種昆蟲防御素。后來Dimarcq等先從果蠅中分離到1種病原菌誘導(dǎo)的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)果蠅的防御素基因是單拷貝且無內(nèi)含子，據(jù)此推測昆蟲的防御素是獨立進化而來的。后來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲防御素與哺乳動物防御素在二硫鍵的連接方式以及三維空間構(gòu)型上是截然不同的，從而證明了昆蟲防御素和哺乳動物防御素不具同源性。絕大多數(shù)昆蟲的防御素帶1個凈正電荷，分子量為 4ku 左右，由34～51個氨基酸組成，氨基酸序列中都含有6個保守半胱氨酸, 3個分子內(nèi)二硫鍵形成β片狀結(jié)構(gòu)和1個α螺旋結(jié)構(gòu)，二硫鍵以Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6連接。
（三）植物類防御素
在1990年由Mendez等從小麥、大麥種子首先分離得到植物防御素r1-P和r1-H,用NMR光譜法測定其三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與哺乳動物和昆蟲防御素相似。最近Thevissen也通過比較植物和昆蟲防御素與真菌的葡糖苷鞘氨醇的相互作用，得知它們是由同一個前體細胞祖先進化而來的。植物防御素的分子質(zhì)量小于5ku,由45～54個氨基酸組成, 3個分子內(nèi)二硫鍵形成1個反向的β片狀結(jié)構(gòu)和1個α螺旋結(jié)構(gòu)，含有4 對二硫鍵且連接方式為Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6、Cys4-Cys7。
生物活性
（一）抗菌作用
防御素能有效殺滅革蘭陰性細菌和革蘭陽性細菌。在體外濃度為 10～100 mg/L 的防御素即對多種細菌具有殺傷作用，而防御素在中性粒細胞中的濃度為 g/L 級，遠遠超過上述數(shù)值，這表明在體內(nèi)防御素可能具有更強的殺菌活性，目前研究發(fā)現(xiàn)防御素對革蘭陽性細菌的殺傷能力明顯要強于革蘭陰性細菌。在體外，HBD-2 對大腸桿菌的半數(shù)致死量（LD50）為 0.46nmol/ml，最小抑菌濃度（MIC）為 15 μg/ml，而對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的 MIC 為62 μg/ml。體外實驗證明大多數(shù)防御素的 MIC 范圍為0.5-10 μmol/L。
對于防御素抗菌活性機制，大部分研究者認為主要和微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。防御素發(fā)揮抗菌作用可分為三個階段:
(3)內(nèi)容物外泄。通道形成后，防御素進入細胞內(nèi)的同時，其他胞外分子也伴隨進入(如肽、蛋白質(zhì)或無機離子),而靶細胞的重要物質(zhì)(如鹽離子和大分子)滲出，致使靶細胞發(fā)生不可逆損傷而死亡。
防御素還能通過誘導(dǎo)細胞因子的釋放和介導(dǎo)非成熟性的樹突狀細胞協(xié)同刺激分子的表達上調(diào)，促進IDC 的成熟，進而活化T 細胞，觸發(fā)特異性免疫應(yīng)答。
（二）抗病毒作用
防御素能殺滅一些被膜病毒，如 HIV、皰疹病毒、水泡型口炎病毒，但對無衣殼病毒卻無效。θ-防御素還具有抗濾過性病原體和抗毒素作用。體內(nèi)實驗顯示，防御素可延緩或根除兔梅毒病，并使兔牙周炎齦下菌群恢復(fù)正常。防御素主要通過與病毒外殼蛋白結(jié)合從而導(dǎo)致病毒喪失生物活性，這一特殊作用機理也使得微生物不易對其產(chǎn)生抵抗性。防御素可直接抑制病毒，對病毒的抑制程度依賴于防御素濃度以及分子內(nèi)二硫鍵的緊密程度，其抗病毒功效同樣受時間、pH 值、離子強度和溫度等因素的影響，在中性及低離子強度條件下，防御素具有較強的抗病毒活性，而在實驗體系中加入血清或血清蛋白則可大大削弱防御素的抗病毒功效。有關(guān)防御素的抗病毒作用機理，大體上可以總結(jié)為如下三點：
1、閉門羹---- 阻止病毒入侵宿主細胞
防御素阻止病毒入侵宿主細胞
防御素則斜插在糖蛋白上以防病毒向細胞糖蛋白的擴散（見圖二），讓病毒吃個“閉門羹”無法進入細胞。沒能進入細胞的病毒接著會被免疫系統(tǒng)的細胞摧毀。
防御素
2、突破口----殺滅病毒
萬一病毒進入細胞內(nèi)，防御素可以與細胞膜表面促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH)，人硫酸肝素糖蛋白（HSPG），低密度脂蛋白受體（LDLR）等相結(jié)合，從而啟動G蛋白偶聯(lián)型受體的級聯(lián)放大反應(yīng)，進一步激活磷酸激酶C。這些細胞信使作用就像埋伏在胞內(nèi)的地雷，可以阻止整合到宿主基因組之前的病毒復(fù)合體進入細胞核或者阻止病毒的基因轉(zhuǎn)錄。整合不到宿主基因組的病毒隨后被摧毀。
防御素
防御素對正常和惡性哺乳動物細胞都表現(xiàn)出非特異性的細胞毒作用，并且對人淋巴細胞及實體瘤細胞的細胞毒作用更為顯著，尤其對抗 TNF 的 U9TR 細胞、抗NK細胞細胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 細胞和人組織細胞淋巴瘤 U937 細胞具有殺傷性。在體外，HNP可抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的活性，HNP的細胞毒活性部分依賴于靶細胞膜脂質(zhì)成分的代謝活性，它還可以與過氧化氫酶協(xié)同誘導(dǎo)細胞毒作用。體外觀察純化防御素對人及小鼠數(shù)種腫瘤細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)防御素對白血病細胞系、淋巴瘤細胞系及實體瘤細胞均具有細胞毒作用，并且這種抗腫瘤功效與其作用時間和劑量呈正相關(guān)。
（四）免疫調(diào)節(jié)作用
防御素不僅可以直接抵抗病原微生物，而且還具有免疫調(diào)節(jié)作用。防御素通過細胞信號傳遞的作用，增強非特異性免疫細胞，尤其是巨噬細胞的活性和趨化性。防御素還可以促進機體T細胞的趨化和增殖，增強機體免疫應(yīng)答能力，調(diào)節(jié)特異性免疫，增強生物機體主動防御功能。
防御素能夠作為一種效應(yīng)分子激活巨噬細胞、DC、氣管上皮細胞等細胞表面受體從而啟動獲得性免疫系統(tǒng)，并將先天性免疫和獲得性免疫有機連接。現(xiàn)已證明一些 α-防御素、β-防御素對 T 細胞、單核細胞以及未成熟的 DC 具有趨化活性，可誘導(dǎo)單核細胞和上皮細胞產(chǎn)生細胞因子。
人、鼠、豬、兔的中性粒細胞防御素可以誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒并釋放組胺。β-防御素還能通過與人趨化因子受體6（CCR6）結(jié)合，從而吸引不成熟的樹突狀細胞（DC）和記憶T細胞（Tm）至炎癥部位，激活細胞免疫和體液免疫。此外，防御素還可以直接促進感染部位中性粒細胞的補充和積聚。
防御素
防御素的應(yīng)用
（一）在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
1、防御素與口腔黏膜疾病的關(guān)系
作為機體天然免疫的重要組成部分，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用，與多種口腔黏膜疾病（口腔潰瘍、扁平苔蘚、白斑及口腔念珠菌病等）關(guān)系密切?，F(xiàn)今關(guān)于這方面的研究尚處于起步階段，主要以體外實驗為主，其作用機制也多為推測，而有關(guān)防御素在體內(nèi)的具體作用、有無毒性或其他不良反應(yīng)等方面的研究甚少，還需進一步全面多層次的研究探討，以闡明防御素在口腔黏膜疾病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用及其機制，為口腔黏膜疾病防治提供新的策略。
2、防御素與炎癥性腸病的關(guān)系
克羅恩?。–D）是一種嚴重的腸道慢性炎癥性疾病，病變部位可發(fā)生于消化道的任何部位，病變形式多樣，其發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。腸道防御素是機體抵御外源性致病因子的重要屏障，而克羅恩病患者腸道防御素表達水平卻存在著較大差異?；啬c段病變的克羅恩病患者，回腸潘氏細胞防御素HD-5、HD-6 的表達較正常人和非回腸段病變克羅恩病患者明顯降低，這種變化與 NOD2（nucleotide oligomerization domain）基因突變密切相關(guān)；結(jié)腸組織活檢發(fā)現(xiàn)無 NOD2 基因突變的克羅恩病患者結(jié)腸組織HD-5、HD-6 的表達水平反而增高，而 HD-5、HD-6 水平降低將影響腸道黏膜的天然屏障作用，導(dǎo)致黏膜細菌附著引發(fā)進一步損害。
以往認為潰瘍性結(jié)腸炎（UC）在歐美國家比較多見，但近年來中國文獻報道的病例數(shù)也顯著增多。UC 病變主要累及結(jié)腸，正常人結(jié)腸黏膜很少表達 HD-5 和 HD-6，而UC 患者結(jié)腸上皮細胞中 HD-5 和 HD-6 mRNA 的表達水平顯著高于正常人，且 HD-6 的表達還具有特異性，即在非感染性的結(jié)腸炎組織中表達并不明顯。HBD-1 在腸道上皮細胞呈持續(xù)性表達，且不受外界因子影響，具有基礎(chǔ)防御功能。但應(yīng)用實時 PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn) UC 和克羅恩病結(jié)腸黏膜組織 HBD-1 基因表達水平均有所降低，這將可能促使腸道黏膜抗菌活性下降，從而導(dǎo)致細菌入侵機體引發(fā)炎癥反應(yīng)。在 UC 患者的病變結(jié)腸組織中，HBD-2 可被誘導(dǎo)性表達，而 HBD-3 的表達水平和 HBD-2 存在一定的相關(guān)性，其在 UC 時表達亦有明顯增加。此外，HBD-4 mRNA的表達水平在 UC 腸上皮細胞中也明顯增高。
慢性阻塞性肺部疾?。–OPD）是一種以氣道受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，患病率及病死率均較高，其中呼吸道感染是COPD 發(fā)病及加劇的一個重要因素。HBD-2 與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系緊密，在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究證實，HBD-2 的產(chǎn)生或作用被抑制后，機體將發(fā)生肺部感染，據(jù)此推測人為補充外源性防御素可能會阻止細菌的定植和感染的發(fā)生。已有研究證實，重組 HBD-2 對肺損傷具有保護作用，可減少綠膿桿菌感染大鼠肺組織的菌落數(shù)。COPD 患者存在氣道、肺實質(zhì)和肺血管炎癥，而肺上皮細胞中高表達的 HBD-2 能通過對肺部炎癥因子的調(diào)節(jié)，阻止全身性炎癥反應(yīng)（SIRS）甚至多器官功能衰竭（MODS）的發(fā)生發(fā)展。此外，重組 HBD-2 還可調(diào)控膿毒癥誘發(fā)的肺組織細胞的過度凋亡，從而減輕肺組織損傷，保護肺功能。
4、防御素的臨床藥用研究
防御素抗菌譜廣泛，作用機理特殊，微生物不宜產(chǎn)生抗藥性，因此具有很大的藥用潛力。2008年，全球首個防御素藥物（PMX-30063）在加拿大完成一期臨床試驗，其對十余種耐藥菌效果顯著。針對金黃色葡萄球菌引起的急性細菌性皮膚感染這一適應(yīng)癥目前已經(jīng)完成Ⅱ期臨床研究。它通過直接靶向細菌細胞膜而達到殺菌的目的，不產(chǎn)生耐藥性，從而有望解決日漸增多的細菌耐藥性問題。
（二）在食品工業(yè)中的應(yīng)用
（三）在畜牧業(yè)中的應(yīng)用
抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生態(tài)平衡，藥物殘留也影響了畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類健康，而來源于哺乳動物的防御素相對分子質(zhì)量較小，熱穩(wěn)定性和水溶性均較好，可以在腸道內(nèi)吸收。由于防御素屬于多肽成分，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解為氨基酸，動物采食后在體內(nèi)一般無殘留。利用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型防御素飼料添加劑或通過日糧添加，都可調(diào)控防御素基因的表達并實現(xiàn)其功效，如減少死胎、木乃伊及殘疾；提高初生重及仔豬出生均勻度；提高仔豬斷奶重、斷奶成活率，降低哺乳期仔豬發(fā)病率；降低哺乳母豬發(fā)病率，減少母、仔豬各種應(yīng)激；改善母豬亞健康和繁殖障礙，延長母豬使用年限；提高保育豬成活率，降低發(fā)病率；提高保育豬日增重、降低料肉比；改善免疫抑制，提高免疫應(yīng)答能力，抗體水平更整齊。
（四）在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用
防御素在農(nóng)業(yè)中可用于農(nóng)作物抗病育種研究，該研究主要是寄希望建立防御素生物反應(yīng)器，大量生產(chǎn)并提純防御素蛋白，以便培育抗性新品種。已有研究者將兔防御素 NP-1轉(zhuǎn)入小麥植株，田間抗病蟲鑒定結(jié)果顯示小麥對于白粉病、葉銹和條銹病的抗性均有較大提高。而將兔防御素 NP-1基因構(gòu)建至植物表達載體中獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株的抗病實驗結(jié)果表明，其對番茄青枯病具有抗性，為番茄的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ)。
基因工程制備
應(yīng)用前景
由于傳統(tǒng)抗生素的毒副作用及耐藥菌株的出現(xiàn)，人們正在努力尋找抗生素的替代品。防御素作為一種新型生物活性肽，其抗菌譜廣泛，與抗生素阻斷大分子生物合成的作用機制完全不同，防御素能夠快速殺滅廣譜病原微生物，而且作為機體本身的一種活性物質(zhì)，相對不具有免疫原性，對其具有抵抗性的細菌較少，病原菌也不易對其產(chǎn)生耐藥性，因此可以替代抗生素發(fā)揮廣譜高效的抗菌作用。
隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展、新防御素基因的不斷涌現(xiàn)、防御素家族研究的不斷深入、高效表達系統(tǒng)和生物反應(yīng)器的不斷更新，我們相信防御素必將作為新一代抗菌藥物走入我們的生活，為人類創(chuàng)造更多的價值。
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