拓?fù)洚悩?gòu)酶（催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合的酶）
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拓?fù)洚悩?gòu)酶
催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合的酶
拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）是指通過(guò)切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來(lái)更正DNA連環(huán)數(shù)的酶。
基本信息
| 中文名 | 拓?fù)洚悩?gòu)酶 |
| 外文名 | topoisomerase |
| 簡(jiǎn)介 | 存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類(lèi)酶 |
| 特點(diǎn) | 能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合 |
簡(jiǎn)介
拓?fù)洚悩?gòu)酶
臨床使用
這些藥物包括阿霉素（adriamycin）、放線霉素D（actinomycinD）、道諾梅素（daunomycin）、VP-16、VM-26（替尼泊苷teniposide或者表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin）。相對(duì)來(lái)說(shuō)，無(wú)論是臨床，還是處在試驗(yàn)階段的，作為哺乳動(dòng)物異構(gòu)酶II型毒素的藥物較多
雙-和四苯咪唑（Chen等，CancerRes.1993,53,1332-1335;Sun等,J.Med.Chem.1995,38,3638-3644；Kim等,J.Med.Chem.1996,39,992-998），某些白屈菜生物堿（benzo[c]phenanthridine）和原小檗堿類(lèi)生物堿（protoberberine）與合成的類(lèi)似體（Makhey等，Med.Chem.Res.1995,5,1-12； Janin等，J.Med.Chem.1975，18，708-713；Makhey等，Bioorg.&Med.Chem.1996,4,781-791），以及bulgerain（Fujii等,J.Biol.Chem.1993，268，），saintopin（Yamashita等，Biochemistry1991，30，5838-5845）和indolocarbazoles(Yamashita等，Biochemistry1992，31，12069-12075)。
其他被確定的拓?fù)洚悩?gòu)酶毒素則包括某些白屈菜生物堿（benzophenanthridine）和cinnoline化合物（見(jiàn)LaVoie等，美國(guó)專利6140328，以及WO01/32631）。盡管這些化合物大有用途，但是由于其較低的溶解性使得他們的應(yīng)用受到限制。
2006年1月下旬，美國(guó)專利局連續(xù)授予了美國(guó)新澤西大學(xué)關(guān)于以拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）為作用靶位的氨基和硝基替代類(lèi)藥物的合成及應(yīng)用的四個(gè)專利。
分類(lèi)
可分為兩類(lèi)一類(lèi)叫拓?fù)洚悩?gòu)酶I，一類(lèi)叫拓?fù)洚悩?gòu)酶II。拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化DNA鏈的斷裂和重新連接，每次只作用于一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈的斷裂和連接，它們不需要能量輔因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I又稱ω蛋白，大白鼠肝DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I又稱切刻-封閉酶(nicking-closing enzyme )。拓?fù)洚悩?gòu)酶II能同時(shí)斷裂并連接雙股DNA鏈．它們通常需要能量輔因子ATP。在拓?fù)洚悩?gòu)酶II中又可以分為兩個(gè)亞類(lèi)：一個(gè)亞類(lèi)是DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNA gyrase )，其主要功能為引入負(fù)超螺旋，在DNA復(fù)制中起十分重要的作用。迄今為止，只有在原核生物中才發(fā)現(xiàn)DNA旋轉(zhuǎn)酶．另一個(gè)亞類(lèi)是轉(zhuǎn)變超螺旋DNA(包括正超螺旋和負(fù)超螺旋)成為沒(méi)有超螺旋的松弛形式(relaxed form )。這一反應(yīng)雖然是熱力學(xué)上有利的方向，但不知道為什么它們?nèi)匀幌馜NA旋轉(zhuǎn)酶一樣需要ATP，這可能與恢復(fù)酶的構(gòu)象有關(guān)。這一類(lèi)酶在原核生物和真核生物中都有發(fā)現(xiàn)。
第一類(lèi)
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶能催化的反應(yīng)很多，這里只能作簡(jiǎn)單敘述。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)單鏈DNA的親和力要比雙鏈高得多，這正是它識(shí)別負(fù)超螺旋DNA的分子基礎(chǔ)，因?yàn)樨?fù)超螺旋DNA常常會(huì)有一定程度的單鏈區(qū)。負(fù)超螺旋越高，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用越快。現(xiàn)已知道，生物體內(nèi)負(fù)超螺旋穩(wěn)定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過(guò)拓?fù)洚悩?gòu)酶1和II的相反作用而使負(fù)超螺旋達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，編碼E．coli拓?fù)洚悩?gòu)酶I的基因topA發(fā)生突變，則會(huì)引起旋轉(zhuǎn)酶基因的代償性突變；否則，負(fù)超螺旋增高，細(xì)胞生活能力降低。拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用的堿基序列特異性不高，但切點(diǎn)一定在C的下游方向4個(gè)堿基(包括C本身)的位置。在將DNA單鏈切斷后，拓?fù)洚悩?gòu)酶I連接于切口的5端，并貯藏了水解磷酸二脂鍵的能量用以連接切口，因而拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用不需能量供應(yīng)。此外．拓?fù)洚悩?gòu)酶I還能促進(jìn)兩個(gè)單鏈環(huán)的復(fù)性，其作用是解除復(fù)性過(guò)程所產(chǎn)生的鏈環(huán)數(shù)的負(fù)值壓力，以使復(fù)性過(guò)程進(jìn)行到底。如果在一個(gè)單鏈環(huán)上一個(gè)部位切斷，而使另一部位繞過(guò)切口．則可產(chǎn)生三葉結(jié)結(jié)構(gòu)分子 (trefoil knot)。如果有兩個(gè)雙鏈環(huán)，其中一個(gè)有一個(gè)切刻，拓?fù)洚悩?gòu)酶1則可以將切刻對(duì)面的一條鏈切斷，伎完整的雙鏈環(huán)套進(jìn)去，再連接起來(lái)而成為環(huán)連體分子(catenane)，以上這三種反應(yīng)示于右圖。拓?fù)洚悩?gòu)酶I還能催化其他反應(yīng)，這將在復(fù)制和重組的機(jī)制中再講述。
第二類(lèi)
大腸桿菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶II(gyrase)除了引入負(fù)超螺旋以外．還具有形成或拆開(kāi)雙鏈DNA環(huán)連體和成結(jié)分子的能力。II類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶沒(méi)有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對(duì)雙鏈DNA結(jié)合。DNA旋轉(zhuǎn)酶有兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基。α亞基約105KDa，為gyrA基因所編碼，具有磷酸二脂酶活性，可為萘啶酮酸(nalidixic acid )所抑制。A亞基約95KD，為graB基因所編碼，具有ATP酶活性，可為新生霉素(novobiocin )所抑制。這兩種藥物均可抑制野生型大腸桿菌的DNA復(fù)制。可見(jiàn)DNA旋轉(zhuǎn)酶為E．coli的復(fù)制所不可缺少的。在切斷一條DNA雙鏈后，兩個(gè)a亞基各結(jié)合于切口的一個(gè)5'端，并貯藏了水解磷酸二酯鍵而獲得的能量，由于該酶的整體性，因而DNA鏈的四個(gè)斷頭并無(wú)任意旋轉(zhuǎn)的可能性。由于酶的別構(gòu)效應(yīng)，使完整的雙鏈穿過(guò)切口，然后再重新形成磷酸二酯鍵。β亞基的功能在于水解ATP以使酶分子恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。這一點(diǎn)可以用ATP的同系物β,γ-亞氨基ATP代替ATP而得到證實(shí)。因?yàn)檫@一同系物不能被DNA旋轉(zhuǎn)酶所水解，但它確能促進(jìn)第一輪拓?fù)洚悩?gòu)反應(yīng)，使負(fù)超螺旋增加，而妨礙以后進(jìn)一步的拓?fù)洚悩?gòu)反應(yīng)。
化學(xué)反應(yīng)
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶催化反應(yīng)
很多，其反應(yīng)本質(zhì)是先切斷DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA的鏈環(huán)數(shù)之后再連接之，兼具DNA內(nèi)切酶和DNA連接酶的功能．然而它們并不能連接事先已經(jīng)存在的斷裂DNA，也就是說(shuō)，其斷裂反應(yīng)與連接反應(yīng)是相互耦聯(lián)的。拓?fù)洚悩?gòu)酶（包括Ⅰ型和II型）都可以用符號(hào)轉(zhuǎn)化模型進(jìn)行解釋（下圖左中）
除了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可以產(chǎn)生異構(gòu)變化以外，很多能夠嵌入相鄰堿基之間影響堿基堆集作用的試劑，特別是片狀的染料分子．也能改變DNA的拓?fù)錉顟B(tài)，最明顯的例子就是溴化乙錠(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子與溴化乙錠的結(jié)合試驗(yàn)為例，當(dāng)沒(méi)有染料時(shí)，此DNA為負(fù)超螺旋，具有較高的沉降常數(shù)(21S)；當(dāng)加入染料分子與核苷酸之比為0.05時(shí)，沉降數(shù)降至l6S，此時(shí)DNA為沒(méi)有超螺旋的松弛形式；當(dāng)染料分子和核苷酸的比值增加到0.09時(shí)，沉降常數(shù)又上升到大約21S，此時(shí)DNA分子為正超螺旋。這種關(guān)系如上圖右所示，不過(guò)要注意的是，溴化乙錠并沒(méi)有改變Lk值，只不過(guò)是由溴化乙錠分子的嵌入，增加了局部DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的緊纏狀態(tài)。因而，隨著嵌入染料分子數(shù)的增多，起初表現(xiàn)為負(fù)超螺旋的減少與消失，隨后便是正超螺旋的增加。這與單鏈DNA結(jié)合蛋白促進(jìn)負(fù)超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)榕轄罱Y(jié)構(gòu)的情況是類(lèi)似的。
拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）:通過(guò)切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來(lái)改變DNA連環(huán)數(shù)的酶。DNA促旋酶。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topoisomerase）
為催化DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開(kāi)和結(jié)合的偶聯(lián)反應(yīng)，為了分析體外反應(yīng)機(jī)制，用環(huán)狀DNA為底物。在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓?fù)鋵W(xué)轉(zhuǎn)變中，要暫時(shí)的將DNA的一個(gè)鏈或兩個(gè)鏈切斷，根據(jù)異構(gòu)體化的方式而分為二個(gè)型。切斷一個(gè)鏈而改變拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的稱為Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（top- oisomeraseⅠ），通過(guò)切斷二個(gè)鏈來(lái)進(jìn)行的稱為Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomeraseⅡ）。屬于Ⅰ型的拓?fù)洚悩?gòu)酶，有大腸桿菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11萬(wàn)的單個(gè)多肽鏈所成）及各種真核細(xì)胞中存在的切斷-結(jié)合酶（nicking-closing enzyme，分子量約6萬(wàn)5千—7萬(wàn)的及分子量約10萬(wàn)的）。Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，有存在于細(xì)菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ以及真核細(xì)胞中依賴ATP的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ等。另外，噬菌體λ的irt基因產(chǎn)物和噬菌體φX174的基因A的產(chǎn)物等也具有切斷—結(jié)合酶的活性，可認(rèn)為是拓?fù)洚悩?gòu)酶之一種。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶不需要ATP的能量而催化異構(gòu)體化，作為反應(yīng)的中間產(chǎn)物，在原核生物來(lái)說(shuō)是游離型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端與酶形成共價(jià)鍵，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端與酶形成共價(jià)鍵。此酯鍵中所貯存的能量，可能在切斷端的再結(jié)合上起著作用。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)化酶催化的反應(yīng)有下列各種：使超螺旋DNA在每一切斷—結(jié)合反應(yīng)中，使L數(shù)（參見(jiàn)DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體）發(fā)生一種變化，即松弛（relaxation）。將互補(bǔ)的單鏈環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈環(huán)狀DNA，使單鏈DNA打結(jié)（topological knot）或解結(jié)。另外在二個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA一個(gè)分子的一個(gè)鏈切斷時(shí)，形成鏈環(huán)狀二聚體的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶中，DNA促旋酶可單獨(dú)催化閉環(huán)狀DNA產(chǎn)生超螺旋，這是獨(dú)特的。其它二個(gè)型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，還可催化促旋酶的催化反應(yīng)。真核細(xì)胞的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，參與核小體的形成，細(xì)菌的ω蛋白參與轉(zhuǎn)錄和某種轉(zhuǎn)位子的插入。促旋酶和T4拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ參與DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I （DNA Topoisomerase I）催化4種反應(yīng)：
①超螺旋的松弛；
②繩結(jié)(knot)的形成；
③環(huán)狀雙鏈分子的形成；
④環(huán)狀雙鏈分子的連接。本酶由于來(lái)源于小牛胸腺，與來(lái)源于原核生物的酶性質(zhì)不同，即使在Mg2+不存在的條件下也顯示活性。而且，原核生物由來(lái)的DNA Topoisomerase I 只作用負(fù)鏈的超螺旋分子，而本酶則能使正負(fù)兩方的超螺旋分子均形成松散型。
用途
DNA的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和解析
Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶
Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶巧妙地執(zhí)行了打開(kāi)DNA雙螺旋的過(guò)程。它將DNA的一個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)切開(kāi)，并讓另一個(gè)螺旋從缺口處穿過(guò)，在此之后一個(gè)雙螺旋便被打開(kāi)。這里顯示的圖片是由兩個(gè)蛋白構(gòu)建的：這個(gè)編號(hào)為1bgw的蛋白具有拓?fù)洚悩?gòu)酶的下半部分結(jié)構(gòu)，另外一個(gè)編號(hào)為1eil的蛋白來(lái)自于一個(gè)旋轉(zhuǎn)酶的結(jié)構(gòu)域，它與拓?fù)洚悩?gòu)酶的上部很相似。拓?fù)洚悩?gòu)酶具有很高的催化活性，它具有一些類(lèi)似于“門(mén)”的結(jié)構(gòu)，控制著DNA進(jìn)入到其上面的兩個(gè)裂口內(nèi)。此處用紅色顯示的兩個(gè)酪氨酸與DNA鏈相結(jié)合并形成共價(jià)鍵，并且這種緊密的結(jié)合方式直到DNA重新恢復(fù)為止。
作用
是使超級(jí)螺旋松弛。所謂超級(jí)螺旋是DNA中張力積聚的形式。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制成分是重要抗腫瘤藥物，被認(rèn)為通過(guò)穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶與DNA之間所形成的一種共價(jià)復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用，后者又為DNA復(fù)制機(jī)制設(shè)置了一障礙。科學(xué)家對(duì)以拓?fù)洚悩?gòu)酶為作用目標(biāo)的藥物的藥效起源仍不是很了解。本期封面圖片所示為由于該藥物的作用而造成的正向DNA超級(jí)螺旋的積累。DNA的這種超級(jí)纏繞會(huì)妨礙一種DNA聚合酶的前行，并且在阻止或破壞復(fù)制叉，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡過(guò)程中也可能扮演一個(gè)角色。
新發(fā)現(xiàn)
DNA螺旋與拓?fù)洚悩?gòu)酶相互作用的新發(fā)現(xiàn)
一個(gè)荷蘭人領(lǐng)導(dǎo)的國(guó)際性研究組在分子水平上破解了自然釋放DNA中積累起來(lái)的扭曲張力的機(jī)制。來(lái)自Delft理工大學(xué)、Ecole Normale Superieure和Sloan-Kettering研究所的研究人員將他們的發(fā)現(xiàn)公布在3月31日的《自然》雜志上，并成為這一期雜志的封面。
IB型拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠釋放DNA鏈中積累的扭力。研究過(guò)程中，研究人員能夠在分子水平上跟蹤一個(gè)單個(gè)的拓?fù)洚悩?gòu)酶分子一段時(shí)間內(nèi)在單個(gè)DNA分子上的活動(dòng)。拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠夾著DNA、切開(kāi)兩個(gè)DNA鏈中的一個(gè)并使DNA在與粘性末端重新結(jié)合在一起前變得舒展。在靈敏的檢測(cè)儀器的幫助下，研究人員能夠測(cè)量不同參數(shù)，如在酶空腔中的旋轉(zhuǎn)的DNA的摩擦力。這項(xiàng)研究對(duì)DNA和這種酶之間的相互作用有了新的了解。
DNA的兩個(gè)單鏈紐在一起并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，而雙鏈的堿基對(duì)序列儲(chǔ)存著遺傳信息。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，遺傳物質(zhì)被復(fù)制并且負(fù)責(zé)復(fù)制的酶必須能夠?qū)⑦@些堿基序列轉(zhuǎn)錄。但是要實(shí)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程就必須將需要轉(zhuǎn)錄的DNA部分變直。這種纏繞和舒展共存的DNA分子中產(chǎn)生了扭力，其扭力的大小隨著細(xì)胞分裂過(guò)程的發(fā)展而增加。這種力能夠延遲細(xì)胞分裂過(guò)程并且在一些情況下甚至終止分裂，而IB型拓?fù)洚悩?gòu)酶則能減少這些扭力。
這種酶釋放DNA扭力的步驟如下：拓?fù)洚悩?gòu)酶先像夾子一樣夾住雙鏈DNA，然后瞬時(shí)穿過(guò)兩條DNA鏈中的其中一條。DNA分子中積累的這種扭力然后在完整鏈附近被消磨掉。在旋轉(zhuǎn)之后，這種酶再次緊緊抓住旋轉(zhuǎn)的DNA并將斷裂的鏈重新粘連起來(lái)。研究人員能夠測(cè)定出這種拓?fù)洚悩?gòu)酶在剪切和粘連過(guò)程之間卸掉的超螺旋的確切數(shù)目。
IB型拓?fù)洚悩?gòu)酶工作的精確機(jī)制還對(duì)癌癥研究有重要意義。能夠抑制IB拓?fù)洚悩?gòu)酶功能的藥物已在臨床上有所使用，但它們的使用可能在獲得這些發(fā)現(xiàn)后得到改善。
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