紫外－可見(jiàn)分光光度法（鑒別、檢查和測定雜質(zhì)的方法）
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紫外－可見(jiàn)分光光度法
鑒別、檢查和測定雜質(zhì)的方法
紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800nm波長(cháng)范圍內測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當光穿過(guò)被測物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長(cháng)不同而變化。因此，通過(guò)測定物質(zhì)在不同波長(cháng)處的吸光度，并繪制其吸光度與波長(cháng)的關(guān)系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長(cháng)λmax和最小吸收波長(cháng)λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結構相關(guān)的特征性。因此，可以通過(guò)特定波長(cháng)范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較，或通過(guò)確定最大吸收波長(cháng)，或通過(guò)測量?jì)蓚€(gè)特定波長(cháng)處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時(shí)，在最大吸收波長(cháng)處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數法求算出樣品溶液的濃度。
基本信息
| 中文名 | 紫外-可見(jiàn)分光光度法 |
| 外文名 | ultraviolet&visible spectrophotpmetry |
| 特點(diǎn) | 操作簡(jiǎn)單、準確度高 |
| 組成部分 | 輻射源、單色器等 |
| 性質(zhì) | |
| 簡(jiǎn)稱(chēng) | UV-Vis |
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原理或術(shù)語(yǔ)
光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時(shí)，測量由物質(zhì)內部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長(cháng)和強度進(jìn)行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動(dòng)、轉動(dòng)光譜，電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過(guò)測定被測物質(zhì)在特定波長(cháng)處或一定波長(cháng)范圍內的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
常用檢測儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度計。
原理如下：
單色光輻射穿過(guò)被測物質(zhì)溶液時(shí)，在一定的濃度范圍內被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(cháng)度）成正比，其關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表述如下：
式中
A為吸光度；
T為透光率；
E為吸收系數，常用的表示方法，其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數值；
c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無(wú)水物計算），g；
l（L）為液層厚度，cm。
分光光度計
紫外-可見(jiàn)分光光度計由5個(gè)部件組成：①輻射源。必須具有穩定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長(cháng)范圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱(chēng)吸收池。供盛放試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見(jiàn)區，后者只適用于可見(jiàn)區。容器的光程一般為0.5～10厘米。④檢測器，又稱(chēng)光電轉換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來(lái)還使用光導攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點(diǎn)。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級的光度計，常備有微處理機、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數據和操作條件都顯示出來(lái)。
儀器類(lèi)型則有：?jiǎn)尾ㄩL(cháng)單光束直讀式分光光度計，單波長(cháng)雙光束自動(dòng)記錄式分光光度計和雙波長(cháng)雙光束分光光度計。
儀器校正檢定
1.波長(cháng)
由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長(cháng)經(jīng)常會(huì )略有變動(dòng)，因此除應定期對所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長(cháng)。常用汞燈中的較強譜線(xiàn)237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線(xiàn)進(jìn)行校正；鈥玻璃在波長(cháng)279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長(cháng)校正用，但因來(lái)源不同或隨著(zhù)時(shí)間的推移會(huì )有微小的變化，使用時(shí)應注意；近年來(lái)，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（
）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長(cháng)為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。
儀器波長(cháng)的允許誤差為：紫外光區±1nm，500nm附近±2nm。
2.吸光度的準確度
波長(cháng)/nm | 235（最小） | 257（最大） | 313（最小） | 350（最大） |
吸收系數( )的規定值 | 124.5 | 144.0 | 48.6 | 106.6 |
吸收系數( )的許可范圍 | 123.0～ 126.0 | 142.8～ 146.2 | 47.0～ 50.3 | 105.5～ 108.5 |
3.雜散光的檢查
對溶劑要求
含有雜原子的有機溶劑，通常均具有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(cháng)。例如甲醇、乙醇的截止使用波長(cháng)為205nm。另外，當溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(cháng)附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm 范圍內不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內不得超過(guò)0.20，在251～300nm范圍內不得超過(guò)0.10，在300nm以上時(shí)不得超過(guò)0.05。
測定法
測定時(shí)，除另有規定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規定的吸收峰波長(cháng)±2nm以?xún)葴y試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規定波長(cháng)附近自動(dòng)掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長(cháng)位置是否正確，除另有規定外，吸收峰波長(cháng)應在該品種項下規定的波長(cháng)±2nm以?xún)龋⒁晕舛茸畲蟮牟ㄩL(cháng)作為測定波長(cháng)。一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會(huì )偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增大為準，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數后再計算含量。
當溶液的pH值對測定結果有影響時(shí)，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。
1.鑒別和檢查分別按各品種項下規定的方法進(jìn)行。
2.含量測定一般有以下幾種方法。
（1）對照品比較法
按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規定的波長(cháng)測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度∶
式中
為供試品溶液的濃度；
（2）吸收系數法
按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規定的波長(cháng)處測定其吸光度，再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時(shí)，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。
（3）計算分光光度法
計算分光光度法有多種，使用時(shí)應按各品種項下規定的方法進(jìn)行。當吸光度處在吸收曲線(xiàn)的陡然上升或下降的部位測定時(shí)，波長(cháng)的微小變化可能對測定結果造成顯著(zhù)影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。
（4）比色法
供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區沒(méi)有強吸收，或在紫外光區雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當的顯色劑，使反應產(chǎn)物的最大吸收移至可見(jiàn)光區，這種測定方法稱(chēng)為比色法。
用比色法測定時(shí)，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應試劑為空白，在各品種規定的波長(cháng)處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線(xiàn)，再根據供試品的吸光度在標準曲線(xiàn)上查得其相應的濃度，并求出其含量。
也可取對照品溶液與供試品溶液同時(shí)操作，顯色后，以相應的試劑為空白，在各品種規定的波長(cháng)處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計算供試品溶液的濃度。
除另有規定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理制得。
參考資料
[1]
藥物分析法：紫外可見(jiàn)分光光度法 · 醫學(xué)教育網(wǎng)[引用日期2021-07-30]
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