紙上層析（濾紙為惰性支持物的分配層析）

操作方法

操作時(shí)，先要點(diǎn)樣。取少量試樣，用水或易揮發(fā)的有機溶劑（如乙醇、丙酮等）使它完全溶解，配制成濃度約1%的溶液。在濾紙上距一端約2～3厘米處用鉛筆畫(huà)一記號作為原點(diǎn)，用毛細管或微量注射針筒吸取少量試樣溶液在原點(diǎn)滴一小滴，每滴試樣體積為0.002～0.02毫升，控制點(diǎn)樣直徑在0.3～0.5厘米左右。晾干后再在原點(diǎn)處重復上述操作1～2次。將已點(diǎn)樣并晾干的濾紙懸掛在層析槽內，并使濾紙下端（有點(diǎn)樣一端）邊緣浸入展開(kāi)劑液面下約0.5～1厘米，但點(diǎn)樣的位置必須在展開(kāi)劑液面之上，將層析槽蓋上。借助于毛細現象，展開(kāi)劑帶動(dòng)試樣中各組分以不同速度沿濾紙逐漸向上移動(dòng)，因各組分在固定相和流動(dòng)相中溶解度不同，從而使混合物中各組分在流動(dòng)相中移動(dòng)距離不同而得到展開(kāi)。有的組分展開(kāi)后就可顯示出不同顏色，但有的組分展開(kāi)后不顯色，還要進(jìn)行顯色反應。一般可用顯色劑噴霧法使各組分顯色，如分離甲基橙和酚酞時(shí)用氨水作顯色劑，酚類(lèi)可用三氯化鐵的乙醇溶液顯色，也有用紫外光照射顯色的。

實(shí)驗目的

⒈了解紙上層析的原理、應用以及中學(xué)化學(xué)課本引進(jìn)紙上層析實(shí)驗的意義。

⒉探索做好紙上層析演示實(shí)驗的技術(shù)關(guān)鍵，掌握這個(gè)實(shí)驗的操作方法。

實(shí)驗原理

紙上層析是用濾紙作為支持劑（載體）的一種色層分析法，這種方法的基本原理一般認為主要是利用混和物中各組分在流動(dòng)相和固定相間的分配比的不同而使之分離。

在本實(shí)驗中，以濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸附20%左右的水），有機溶劑如正丁醇或乙醇（都含有一定比例的水）等為流動(dòng)相，酚酞、甲基橙混和物或紅、藍墨水混和物為層析試樣。把試樣點(diǎn)在濾紙的原點(diǎn)位置上，當流動(dòng)相溶劑在濾紙的毛細管作用下，連續不斷地沿著(zhù)濾紙前進(jìn)通過(guò)原點(diǎn)時(shí)，試樣中各組分便隨著(zhù)流動(dòng)相溶劑向前移動(dòng)，并在流動(dòng)相和固定相溶劑之間連續發(fā)生一次又一次的分配。結果，分配比較大的物質(zhì)移動(dòng)速度較快，移動(dòng)的距離較遠；分配比較小的物質(zhì)移動(dòng)速度慢，移動(dòng)的距離較近。這樣，便把試樣中各組分分開(kāi)聚集在濾紙的不同位置上。這種分離過(guò)程叫展開(kāi)。因此，流動(dòng)相溶劑又叫做展開(kāi)劑。

當分離的物質(zhì)是有色的，如甲基橙，層析后在濾紙上可以直接看出它的色斑。當分離的是無(wú)色的物質(zhì)，如酚酞，就必須用顯色劑使之顯色。無(wú)色的酚酞可以用氨水使之顯紅色，所用的氨水就是顯色劑。

紙上層析可用于化學(xué)性質(zhì)相近的混和物的分離，特別適宜于微量物質(zhì)的分離和鑒別。而且使用的儀器簡(jiǎn)單，操作比較容易，重現性好。目前，紙上層析已運用到有機化學(xué)、無(wú)機化學(xué)、生物化學(xué)及生理學(xué)的定性、定量分析中。例如利用紙上層析法使蛋白質(zhì)所包含的幾十種氨基酸在一張濾紙上全部分離開(kāi)；又如在稀有、稀土、放射性元素和核裂解產(chǎn)物等的分離和鑒定上，也用列紙上層析法，都有較好的效果。

實(shí)驗用品

儀器：

大試管（30mm×200mm）（帶橡皮塞） 5支

移液管（10ml) 2支

大試管架（大孔） 1個(gè)

培養皿（直徑8cm) 5只

玻璃毛細管（長(cháng) 8cm) 2支

剪刀（公用）小刀（公用）

藥品：

酚酞、甲基橙混和溶液：配制法是取甲基橙、酚酞各0.1g，溶于10ml60%乙醇中。

氨水的正丁醇飽和溶液：配制法是先用濃氨水配制成2∶8稀氨水（2ml濃氨水∶8 ml蒸餾水）40ml，慢慢注入20ml正丁醇中，充分振蕩。靜置后液體分為兩層，上層即氨水的正丁醇飽和溶液。

乙醇與氨水的混和溶液：配制法是用乙醇與1mol/L氨水按體積比2∶1（6ml無(wú)水乙醇∶1ml氨水）混和。市售白酒。

氨化市售白酒：配制方法是用市售白酒與濃氨水按體積比10∶1（10ml市售白酒：1ml濃氨水）混和。

紅藍墨水混合液：配制法是用紅藍墨水按體積比 1∶1（1ml紅墨水∶1ml藍墨水）混和。

濃氨水。

材料：

濾紙：圓形（直徑9cm）慢速、中速、快速定性濾紙各5張；長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙各5條。

鉛筆（公用）。

小鐵釘。

實(shí)驗步驟

本次實(shí)驗使用兩種不同的層析混和物，四種不同的展開(kāi)劑，兩種不同的展開(kāi)方法和四種不同規格的濾紙作支持劑，進(jìn)行10組（共25次）對比實(shí)驗。要注意掌握紙上層析的技術(shù)，總結本實(shí)驗成功的條件，探索改進(jìn)實(shí)驗的方法。

（一）酚酞和甲基橙混和溶液的紙上層析

⒈以氨水的正丁醇飽和溶液作展開(kāi)劑（氨是顯色劑。本實(shí)驗把顯色劑加在展開(kāi)劑里，配成氨水的正丁醇飽和溶液，目的是為了簡(jiǎn)化操作手續，便于使學(xué)生直接觀(guān)察實(shí)驗現象）。

⑴利用長(cháng)條形濾紙進(jìn)行層析（上行展開(kāi)）

分別利用長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙按下列操作進(jìn)行試驗并對比試驗的效果。

i.準備：取一支帶橡皮塞（塞子底端中間切有一條縫隙）的清潔、干燥的大試管（30mm×200mm）。配合大試管的內徑和管長(cháng)，裁取一長(cháng)條濾紙，紙條的寬度比試管的內徑略窄（約24mm）；長(cháng)度按塞子底端到近試管底的距離（約180mm）。（裁取時(shí)，要求濾紙的紙紋均勻一致而且沒(méi)有斜紋；紙面要清潔而平整；紙邊要剪齊而無(wú)紙毛）。

ii 點(diǎn)樣：在準備好的長(cháng)條形濾紙的一端距端邊約2 cm處的正中，用鉛筆畫(huà)一個(gè)小“×”號表示原點(diǎn)的位置，于此“×”號處用玻璃毛細管點(diǎn)上酚酞和甲基橙的混和溶液試樣，點(diǎn)好的試樣斑點(diǎn)的直徑以不超過(guò)0.4cm為宜。

iii展開(kāi)：用移液管量取約10ml氨水的正丁醇飽和溶液，小心地將溶液轉移到大試管中（注意：勿使溶液濺到試管上部?jì)缺冢Ⅻc(diǎn)好試樣的條形濾紙的另一端夾在橡皮塞底端中間的縫隙里，然后小心地將濾紙條伸入盛有展開(kāi)劑的大試管中，塞上橡皮塞，使濾紙垂直而兩側不接觸試管內壁（否則會(huì )造成展開(kāi)劑不按水平線(xiàn)平行上升，影響展開(kāi)效果）；濾紙條的下端浸入溶液液面下約1cm（勿使試樣斑點(diǎn)浸入溶液之中），如圖6—1。

塞好（注意密閉！）橡皮塞后，將大試管靜置于試管架上，觀(guān)察現象。記錄酚酞與甲基橙完全分離開(kāi)的時(shí)間，以及二者分開(kāi)后的顏色與相對位置（前后）。

iv 結束：取出濾紙條，立即用鉛筆在展開(kāi)劑到達的前沿處作一記號。

如果酚酞顯色不鮮明，這是因展開(kāi)劑上升到一定高度，水分減少，NH3在無(wú)水情況下不能使酚酞顯紅色之故。可將取出的濾紙條用水蒸氣熏片刻，然后再用濃氨水熏一下；或將濾紙條倒置（展開(kāi)劑前沿向下），在展開(kāi)劑前沿處滴少許氨水；或事先把濾紙條上部（要控制好上部位置）用水潤濕，待酚酞隨正丁醇上升到被水潤濕處則可顯紅色。

⑵利用圓形濾紙進(jìn)行層析（環(huán)形展開(kāi)或徑向展開(kāi)）

分別用圓形慢速、中速、快速定性濾紙按下列操作進(jìn)行試驗，并對比試驗的效果。

i.準備：選好所需規格的圓形濾紙，濾紙的直徑應比所用的培養皿（或其它淺皿）的直徑略大。再用寬1cm左右的濾紙條卷成直徑為0.15—0.2cm的濾紙芯。

ii.點(diǎn)樣：取一張選好的（直徑約9cm）圓形濾紙，在圓心位置上用玻璃毛細管點(diǎn)上酚酞和甲基橙的混和溶液，點(diǎn)好的試樣斑點(diǎn)直徑約0.5cm，晾干。

iii.展開(kāi)：在試樣斑點(diǎn)的中心位置上用小鐵釘穿一個(gè)小圓孔，小圓孔的直徑約0.15—0.2 cm。取一段長(cháng)約1.5cm的濾紙芯，垂直插入小圓孔中，使濾紙芯的上端稍冒出濾紙平面。

量取約10ml氨水的正丁醇飽和溶液，注入直徑為8 cm的培養皿中，將準備好的圓形濾紙蓋在培養皿上，使紙芯下端浸入展開(kāi)劑中，再罩上培養皿蓋。如圖6—2所示。

靜置，觀(guān)察所發(fā)生的現象，記錄觀(guān)察到的現象和酚酞與甲基橙完全分離的時(shí)間。

iv.結束、取下圓形濾紙，其后的操作同（一）-1-⑴-iv。

⒉以乙醇和氨水的混和溶液作展開(kāi)劑（氨是顯色劑）。

⑴利用長(cháng)條濾紙進(jìn)行層析(上行展開(kāi)）

分別用長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗的效果。除更換展開(kāi)劑外，操作方法同（一)-1-⑴。

⑵利用圓形濾紙進(jìn)行層析（環(huán)形展開(kāi)或徑向展開(kāi)）。

分別用圓形慢速、中速、快速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗的效果。除更換展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑵。

⒊以氨化市售白酒作展開(kāi)劑（氨是顯色劑）。⑴利用長(cháng)條濾紙進(jìn)行層析（上行展開(kāi)）

分別用長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗的效果。除更換展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑴。

⑵利用圓形濾紙進(jìn)行層析（環(huán)形展開(kāi)或徑向展開(kāi)）

分別用慢速、中速、快速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗效果。除更換展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑵。

（二）紅、藍墨水混和液的紙上層析。

⒈以市售白酒作展開(kāi)劑。

用紅、藍墨水混和液作色層分析可不必另行顯色。⑴利用長(cháng)條濾紙進(jìn)行層析（上行展開(kāi)）。

分別用長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗的效果。除更換層析混和物及展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑴。

⑵利用圓形濾紙進(jìn)行層析（環(huán)形展開(kāi)或徑向展開(kāi)）。

分別用圓形慢速、中速、快速定性濾紙進(jìn)行試驗，并對比試驗效果。除更換層析混和物及展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑵。

⒉以氨化市售白酒作展開(kāi)劑。

⑴利用長(cháng)條形濾紙進(jìn)行層析（上行展開(kāi)）

分別用長(cháng)條形層析濾紙和中速定性濾紙進(jìn)行試驗，對比試驗效果，并注意與使用未氨化的市售白酒作展開(kāi)劑的實(shí)驗效果對比。除更換層析混和物及展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑴。

⑵利用圓形濾紙進(jìn)行層析（環(huán)形展開(kāi)或徑向展開(kāi)）。

分別用圓形慢速、中速、快速定性濾紙進(jìn)行試驗，對比試驗效果，并注意與使用未氨化的市售白酒作展開(kāi)劑的實(shí)驗效果對比。除更換層析混和物及展開(kāi)劑之外，操作方法同（一）-1-⑵。

討論總結

根據以下討論題目，總結寫(xiě)出書(shū)面報告。并附交一份你這次實(shí)驗中較好的層析作品。

⒈根據你在以上各次紙上層析實(shí)驗中的操作條件（包括層析混和物、展開(kāi)劑、顯色劑、濾紙的選擇、展開(kāi)方法等）及實(shí)驗效果（包括混和物分離的時(shí)間、分開(kāi)后的顏色和相對位置等），列表（自行設計）整理實(shí)驗記錄，對比總結兩種展開(kāi)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，分析選擇出較佳的實(shí)驗條件。你認為做好紙上層析演示實(shí)驗應注意哪些事項?

⒉根據你自己實(shí)驗的體會(huì )，對中學(xué)化學(xué)課本中所述紙上層析演示實(shí)驗的步驟和操作方法提出你的看法。

⒊本實(shí)驗把顯色劑加在展開(kāi)劑中，對實(shí)驗效果有無(wú)影響?（可進(jìn)一步實(shí)驗驗證）。

⒋你認為在中學(xué)演示紙上層析實(shí)驗時(shí)，還可采用其它哪些層析混和物、展開(kāi)劑、顯色劑、更為簡(jiǎn)便易.

相關(guān)實(shí)驗

Fe3+和Cu2+的紙上層析

⑴在濾紙中心滴一滴氯化鐵和硫酸銅的混合液，液滴直徑約0.5厘米，防止待干。

⑵把上述的濾紙剪開(kāi)一小口，剪到點(diǎn)樣痕跡，小條寬2-3厘米。把小條向上折至直角。

⑶把折好的濾紙放在一盛有10毫升的丙酮－鹽酸溶液的培養皿上，使剪開(kāi)的小條浸入混合液。

⑷待濾紙的中心的樣點(diǎn)痕跡的直徑展開(kāi)到濾紙直徑的三分之二左右時(shí)，取下濾紙，放在一盛有濃氨水的培養皿上，用氨氣熏。注意不要把氨水直接浸到濾紙上。

⑸不一會(huì )，可以看到濾紙上出現兩個(gè)有色的同心圓圈，外圓是黃色環(huán)，內圓是藍色環(huán)。

甲基橙和酚酞的紙上層析

⑴再濾紙的中心滴一滴甲基橙－酚酞的混合液（或圍繞濾紙中心，距中心約一厘米處滴幾個(gè)點(diǎn)），液滴直徑約0.5厘米，放置待干。

⑵在上述濾之中心扎一個(gè)小洞，插上一根濾紙捻成的細紙芯。

⑶把插好的濾紙芯的濾紙放在有正丁醇－氨水的混合液的培養皿上，使紙芯浸入混合液。隨著(zhù)液體的滲吸，濾紙中心的黃色樣點(diǎn)痕跡向外逐漸擴大，成為黃環(huán)。

⑷待黃環(huán)半徑擴展至濾紙半徑的二分之一時(shí)，取下濾紙，拔下紙芯。等濾紙稍干后，噴上飽和的碳酸鈉溶液，于是在甲基橙外面出現了一個(gè)酚酞的紅環(huán)。