腺病毒載體（基因運載的工具）

病毒概述

腺病毒是無(wú)包膜的線(xiàn)性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型。其基因組長(cháng)約36kb，兩端各有一個(gè)反向末端重復區（ITR），ITR內側為病毒包裝信號。基因組上分布著(zhù)4個(gè)早期轉錄元（E1、E2、E3、E4）承擔調節功能，以及一個(gè)晚期轉錄元負責結構蛋白的編碼。早期基因E2產(chǎn)物是晚期基因表達的反式因子和復制必須因子，早期基因E1A、E1B產(chǎn)物還為E2等早期基因表達所必須。因此，E1區的缺失可造成病毒在復制階段的流產(chǎn)。E3為復制非必須區，其缺失則可以大大地擴大插入容量。腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎，新增了55型（Ad55），很多研究機構在研究當中，55型將比5型流行以及應用更具廣泛性。

作用機制

典型的腺病毒載體系統如：穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細胞293細胞。pCA13/的HCMVIE啟動(dòng)子－多克隆位點(diǎn)－SV40AN（polyA）構成外源基因的表達盒，該表達盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其兩端側翼序列（左側的1~3bp的ITR，右側從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包裝信號φ（194~358bp）；pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分，但是缺失了包裝信號φ、0.5~3.7圖距（mu）部分的E1區、77.5～86.2mu的E3區，293細胞是整合有Ad5E1基因的人胚腎細胞系。pBHG11因為缺失包裝信號及E1區而不能復制，pCA13帶有包裝信號及E1的側翼序列，但是缺失E1區及腺病毒絕大部分基因組，同樣不能復制。外源目的基因插入pCA13后，與pBHG11共轉染，進(jìn)入293細胞。pCA13與pBHG11在細胞內發(fā)生同源重組，同時(shí)，293細胞提供E1蛋白，從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野生型腺病毒相似，具有同樣的感染力進(jìn)入靶細胞的能力，但是基因組DNA的E1區被外源目的基因取代，即進(jìn)入靶細胞后病毒不能復制，但可以表達目的蛋白。

分類(lèi)

第一代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體稱(chēng)為第一代腺病毒載體，此類(lèi)型載體在未經(jīng)過(guò)純化時(shí)可引發(fā)機體產(chǎn)生較強的炎癥反應和免疫反應，純化后可以安全使用，體內表達周期可達4周。

第二代腺病毒載體：E2A或E4基因缺失的腺病毒載體被稱(chēng)為第二代腺病毒載體，產(chǎn)生的免疫反應較弱其載體容量和安全性方面有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒和病毒滴度下降厲害，目前應用相當局限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的（無(wú)病毒載體，gutlessvector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體，miniAd），僅可保留ITR和包裝信號序列。第三代腺病毒載體最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表達引起的細胞免疫反應進(jìn)一步減少，載體中引入核基質(zhì)附著(zhù)區基因可使得外源基因保持長(cháng)期表達，并增加了載體的穩定性。這一載體系統需要一個(gè)腺病毒突變體作為輔助病毒。

目前，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應用最為廣泛的腺病毒載體。一般常用Ad5型腺病毒。

腺病毒載體系統

目前，最主流的腺病毒載體系統有Adeasy系統和AdMax系統。

Adeasy系統：通過(guò)原核重組極大提高了腺病毒的重組效率。其具體的構建步驟如下圖。

AdMax系統：Cre/LoxP體系改造后的真核腺病毒包裝體系，進(jìn)一步增加的操作的便捷，同時(shí)滴度較Adeasy有進(jìn)一步提高。步驟如圖所示。

下面是一些經(jīng)典的AdMax系統質(zhì)粒圖譜：

應用優(yōu)勢

腺病毒載體轉基因效率高，體外實(shí)驗通常接近100%的轉導效率；可轉導不同類(lèi)型的人組織細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞所限；容易制得高滴度病毒載體，在細胞培養物中重組病毒滴度可達（10E+11）/ml；進(jìn)入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高。因而，腺病毒載體在基因治療臨床試驗方面有了越來(lái)越多的應用，成為繼逆轉錄病毒載體之后廣泛應用且最具前景的病毒載體。