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外顯子捕獲
基本信息
| 中文名 | 外顯子捕獲 |
| 外文名 | exon trapping |
| 方法 | 構建一種載體 |
| 目的 | 克隆目的基因 |
操作步驟
(1)基因組DNA經“霰彈法”切成小片段后，克隆在位于“外顯子捕獲序列”下游的克隆位點上。
(2)將這些重組載體匯總后感染反轉錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質產物使載體(自身不能合成病毒蛋白質)成為反轉錄病毒在細胞里增殖。當反轉錄病毒在細胞內轉錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發(fā)生RNA剪接反應而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養(yǎng)液中收集后用來感染兼宿反轉錄病毒包裝細胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉錄病毒再進行一輪復制，并產生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復制時則大大提高了RNA剪接的機會。
基本原理
(5)從COS細胞中回收復制的附加體DNA，經限制性內切酶Dpn I 酶切后轉化細菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上挑選轉化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產物。因此，不產生β—半乳糖苷酶的轉化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉錄病毒生活周期的RNA時期中發(fā)生了剪接反應，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(8)如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕獲陷阱的插入片段中的外顯子序列連接，這可直接測定其序列加以證明。
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這家伙太懶了，什么都沒寫！
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