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全基因組測序（對未知基因組物種進行個體測序）

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全基因組測序

對未知基因組物種進行個體測序

全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序。 1986年， Renato Dulbecco是最早提出人類基因組測序的科學家之一。他認為如果能夠知道所有人類基因的序列，對癌癥的研究將會很有幫助。美國能源部（DOE）與美國國家衛(wèi)生研究院（NIH），分別在1986年與1987年加入人類基因組計劃。除了美國之外，日本在1981年就已經(jīng)開始研究相關(guān)問題，但是并沒有美國那樣積極。到了1988年，詹姆士·華生（DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)者之一）成為NIH的基因組部門主管。1990年開始國際合作。1996年，多個國家召開百慕達會議，以2005年完成測序為目標，分配了各國負責的工作，并且宣布研究結(jié)果將會及時公布，并完全免費。

基本信息

中文名	全基因組測序
測序目標	2005年
準備時間	19世紀80-90年代
國際合作	1990年

研究結(jié)果

①NCI-H209細胞系基因組中，共檢測到22,910個堿基替換、65個插入缺失（Indels）、58個結(jié)構(gòu)變異；在基因組的編碼區(qū)，除了發(fā)現(xiàn)RB1 和TP53基因發(fā)生點突變和MLL2基因由于發(fā)生了G>T的顛換，從而產(chǎn)生了pre-stop codon外，有94個點突變直接改變了氨基酸序列，有36個屬同義突變。

②特定的堿基及其周圍序列易被煙氣中的多環(huán)芳烴和丙烯醛誘變。在NCI-H209細胞系基因組中，G>T/C>A是最為普遍的顛換現(xiàn)象，發(fā)生頻率為34%；其次是G>A/C>T（21%）和A>G/T>C（19%）；CpG島外的CpG二核苷酸多發(fā)生G>T顛換，而CpG島內(nèi)的CpG二核苷酸多發(fā)生G>C顛換，說明煙氣中的致癌物偏好引起甲基化的CpG二核苷酸發(fā)生顛換。

③檢測到轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復（Transcription-coupled repair）和表達相關(guān)的修復（Expression-linked repair）在起作用。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復作用機制：鳥嘌呤和腺嘌呤上大的加合物是吸煙過程中所釋放的致癌化學物質(zhì)引起DNA損傷的主要形式，這些大的加合物阻止了轉(zhuǎn)錄鏈上RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程，而轉(zhuǎn)錄受阻的RNA聚合酶招募核苷酸剪切修復相關(guān)因子對受損的核苷酸進行修復以避免突變發(fā)生。在TP53基因突變的肺癌細胞中，G>T顛換常出現(xiàn)在非轉(zhuǎn)錄鏈，表明在轉(zhuǎn)錄鏈上相同的損傷已被識別和修復。在本研究中，轉(zhuǎn)錄鏈上G和A堿基替換頻率比非轉(zhuǎn)錄鏈上少，由此看來嘌呤是煙氣致癌物質(zhì)主要誘變靶標。另外，在NCI-H209細胞系中，轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈上發(fā)生不同類型的突變（G>T、A>G、A>T）兩條鏈基因表達水平也有差異，這就意味著轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復機制識別、修復不同加合物損傷的能力不同。

表達相關(guān)的修復（Expression-linked repair）作用機制：這是一種新的、更為普遍的修復機制，即，高表達的基因中，轉(zhuǎn)錄鏈及非轉(zhuǎn)錄鏈的突變頻率都較低。在NCI-H209細胞系中，轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈上發(fā)生G>A的突變，兩條鏈上基因表達水平都很高，這就說明表達相關(guān)的修復作用比轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復作用更為重要。

④在SCLC細胞系中，CHD7基因發(fā)生了重排。在NCI-H209細胞系中，CHD7基因3~8外顯子發(fā)生連續(xù)重復，而另外2個LU-135、NCI-H2171細胞系則攜帶PVT1-CHD7融合基因，說明在肺癌中CHD7基因發(fā)生了周期性重排。

以上結(jié)果表明，第二代測序技術(shù)已成為研究與癌癥相關(guān)的基因突變過程、細胞損傷修復路徑、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強有力工具。

簡介

每個人從受精卵開始就繼承了父母的DNA遺傳信息，并且攜帶一生，不易改變。全基因組測序就是通過運用新一代高通量DNA測序儀，進行10-20倍覆蓋率的個人全基因組測序，然后與人類基因組精確圖譜比較，得到完整的個人全基因組序列，破譯個人全部的遺傳信息的過程。

全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個體基因組中的全部遺傳信息；準確性高，其準確率可高達99.99%。

全基因組測序揭示了人類生、老、病、死的奧秘，使人類從根本上認知疾病發(fā)生的原因，做到正確的治療疾病、盡早的預(yù)防疾病。

技術(shù)路線

提取基因組DNA，然后隨機打斷，電泳回收所需長度的DNA片段（0.2~5kb），加上接頭，進行基因簇cluster制備或電子擴增E-PCR，最后利用Paired-End（Solexa）或者Mate-Pair（SOLiD）的方法對插入片段進行測序。然后對測得的序列組裝成Contig，通過Paired-End的距離可進一步組裝成Scaffold，進而可組裝成染色體等。組裝效果與測序深度與覆蓋度、測序質(zhì)量等有關(guān)。目前常用的組裝有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。

原理

雙末端（Paired-End）測序原理

測序深度（SequencingDepth）：測序得到的堿基總量（bp）與基因組大小（Genome）的比值，它是評價測序量的指標之一。測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來的錯誤率或假陽性結(jié)果會隨著測序深度的提升而下降。重測序的個體，如果采用的是雙末端或Mate-Pair方案，當測序深度在10~15X以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。

測序深度對基因組覆蓋度和測序錯誤率的影響

（HOM：純合體HET：雜合體）

全基因組重測序的個體，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP），插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）和結(jié)構(gòu)變異（SV，StructureVariation）位點。SBC可以協(xié)助客戶，通過生物信息手段，分析不同個體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時完成SNP及基因組結(jié)構(gòu)注釋。

測序覆蓋度：基因組被測序得到的堿基覆蓋的比例；測序覆蓋度是反映測序隨機性的指標之一；測序序深度與覆蓋度之間的關(guān)系可以過Lander-Waterman Model（1988）來確定。當深度達到5X時，則可覆蓋基因組的約99.4%以上。

全基因組測序

分析流程

1．數(shù)據(jù)量產(chǎn)出

總堿基數(shù)量、TotalMappingReads、UniquelyMappingReads統(tǒng)計，測序深度分析。

2．一致性序列組裝

與參考基因組序列（Referencegenomesequence）的比對分析，利用貝葉斯統(tǒng)計模型檢測出每個堿基位點的最大可能性基因型，并組裝出該個體基因組的一致序列。

3．SNP檢測及在基因組中的分布

提取全基因組中所有多態(tài)性位點，結(jié)合質(zhì)量值、測序深度、重復性等因素作進一步的過濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對檢測到的變異進行注釋。

4．InDel檢測及在基因組的分布

在進行mapping的過程中，進行容gap的比對并檢測可信的shortInDel。在檢測過程中，gap的長度為1~5個堿基。對于每個InDel的檢測，至少需要3個Paired-End序列的支持。

5．StructureVariation檢測及在基因組中的分布

SBC能夠檢測到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有：插入、缺失、復制、倒位、易位等。根據(jù)測序個體序列與參考基因組序列比對分析結(jié)果，檢測全基因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對檢測到的變異進行注釋。

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