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全基因組測序（對未知基因組物種進(jìn)行個(gè)體測序）

次瀏覽 | 更新時(shí)間：2023-05-19

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全基因組測序

對未知基因組物種進(jìn)行個(gè)體測序

全基因組測序是對未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測序。 1986年， Renato Dulbecco是最早提出人類(lèi)基因組測序的科學(xué)家之一。他認為如果能夠知道所有人類(lèi)基因的序列，對癌癥的研究將會(huì )很有幫助。美國能源部（DOE）與美國國家衛生研究院（NIH），分別在1986年與1987年加入人類(lèi)基因組計劃。除了美國之外，日本在1981年就已經(jīng)開(kāi)始研究相關(guān)問(wèn)題，但是并沒(méi)有美國那樣積極。到了1988年，詹姆士·華生（DNA雙螺旋結構發(fā)現者之一）成為NIH的基因組部門(mén)主管。1990年開(kāi)始國際合作。1996年，多個(gè)國家召開(kāi)百慕達會(huì )議，以2005年完成測序為目標，分配了各國負責的工作，并且宣布研究結果將會(huì )及時(shí)公布，并完全免費。

基本信息

中文名	全基因組測序
測序目標	2005年
準備時(shí)間	19世紀80-90年代
國際合作	1990年

研究結果

①NCI-H209細胞系基因組中，共檢測到22,910個(gè)堿基替換、65個(gè)插入缺失（Indels）、58個(gè)結構變異；在基因組的編碼區，除了發(fā)現RB1 和TP53基因發(fā)生點(diǎn)突變和MLL2基因由于發(fā)生了G>T的顛換，從而產(chǎn)生了pre-stop codon外，有94個(gè)點(diǎn)突變直接改變了氨基酸序列，有36個(gè)屬同義突變。

②特定的堿基及其周?chē)蛄幸妆粺煔庵械?/span>多環(huán)芳烴和丙烯醛誘變。在NCI-H209細胞系基因組中，G>T/C>A是最為普遍的顛換現象，發(fā)生頻率為34%；其次是G>A/C>T（21%）和A>G/T>C（19%）；CpG島外的CpG二核苷酸多發(fā)生G>T顛換，而CpG島內的CpG二核苷酸多發(fā)生G>C顛換，說(shuō)明煙氣中的致癌物偏好引起甲基化的CpG二核苷酸發(fā)生顛換。

③檢測到轉錄偶聯(lián)修復（Transcription-coupled repair）和表達相關(guān)的修復（Expression-linked repair）在起作用。轉錄偶聯(lián)修復作用機制：鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤上大的加合物是吸煙過(guò)程中所釋放的致癌化學(xué)物質(zhì)引起DNA損傷的主要形式，這些大的加合物阻止了轉錄鏈上RNA聚合酶的轉錄過(guò)程，而轉錄受阻的RNA聚合酶招募核苷酸剪切修復相關(guān)因子對受損的核苷酸進(jìn)行修復以避免突變發(fā)生。在TP53基因突變的肺癌細胞中，G>T顛換常出現在非轉錄鏈，表明在轉錄鏈上相同的損傷已被識別和修復。在本研究中，轉錄鏈上G和A堿基替換頻率比非轉錄鏈上少，由此看來(lái)嘌呤是煙氣致癌物質(zhì)主要誘變靶標。另外，在NCI-H209細胞系中，轉錄鏈和非轉錄鏈上發(fā)生不同類(lèi)型的突變（G>T、A>G、A>T）兩條鏈基因表達水平也有差異，這就意味著(zhù)轉錄偶聯(lián)修復機制識別、修復不同加合物損傷的能力不同。

表達相關(guān)的修復（Expression-linked repair）作用機制：這是一種新的、更為普遍的修復機制，即，高表達的基因中，轉錄鏈及非轉錄鏈的突變頻率都較低。在NCI-H209細胞系中，轉錄鏈和非轉錄鏈上發(fā)生G>A的突變，兩條鏈上基因表達水平都很高，這就說(shuō)明表達相關(guān)的修復作用比轉錄偶聯(lián)修復作用更為重要。

④在SCLC細胞系中，CHD7基因發(fā)生了重排。在NCI-H209細胞系中，CHD7基因3~8外顯子發(fā)生連續重復，而另外2個(gè)LU-135、NCI-H2171細胞系則攜帶PVT1-CHD7融合基因，說(shuō)明在肺癌中CHD7基因發(fā)生了周期性重排。

以上結果表明，第二代測序技術(shù)已成為研究與癌癥相關(guān)的基因突變過(guò)程、細胞損傷修復路徑、基因調控網(wǎng)絡(luò )的強有力工具。

簡(jiǎn)介

每個(gè)人從受精卵開(kāi)始就繼承了父母的DNA遺傳信息，并且攜帶一生，不易改變。全基因組測序就是通過(guò)運用新一代高通量DNA測序儀，進(jìn)行10-20倍覆蓋率的個(gè)人全基因組測序，然后與人類(lèi)基因組精確圖譜比較，得到完整的個(gè)人全基因組序列，破譯個(gè)人全部的遺傳信息的過(guò)程。

全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個(gè)體基因組中的全部遺傳信息；準確性高，其準確率可高達99.99%。

全基因組測序揭示了人類(lèi)生、老、病、死的奧秘，使人類(lèi)從根本上認知疾病發(fā)生的原因，做到正確的治療疾病、盡早的預防疾病。

技術(shù)路線(xiàn)

提取基因組DNA，然后隨機打斷，電泳回收所需長(cháng)度的DNA片段（0.2~5kb），加上接頭，進(jìn)行基因簇cluster制備或電子擴增E-PCR，最后利用Paired-End（Solexa）或者M(jìn)ate-Pair（SOLiD）的方法對插入片段進(jìn)行測序。然后對測得的序列組裝成Contig，通過(guò)Paired-End的距離可進(jìn)一步組裝成Scaffold，進(jìn)而可組裝成染色體等。組裝效果與測序深度與覆蓋度、測序質(zhì)量等有關(guān)。目前常用的組裝有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。

原理

雙末端（Paired-End）測序原理

測序深度（SequencingDepth）：測序得到的堿基總量（bp）與基因組大小（Genome）的比值，它是評價(jià)測序量的指標之一。測序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來(lái)的錯誤率或假陽(yáng)性結果會(huì )隨著(zhù)測序深度的提升而下降。重測序的個(gè)體，如果采用的是雙末端或Mate-Pair方案，當測序深度在10~15X以上時(shí)，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。

測序深度對基因組覆蓋度和測序錯誤率的影響

（HOM：純合體HET：雜合體）

全基因組重測序的個(gè)體，通過(guò)序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP），插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）和結構變異（SV，StructureVariation）位點(diǎn)。SBC可以協(xié)助客戶(hù)，通過(guò)生物信息手段，分析不同個(gè)體基因組間的結構差異，同時(shí)完成SNP及基因組結構注釋。

測序覆蓋度：基因組被測序得到的堿基覆蓋的比例；測序覆蓋度是反映測序隨機性的指標之一；測序序深度與覆蓋度之間的關(guān)系可以過(guò)Lander-Waterman Model（1988）來(lái)確定。當深度達到5X時(shí)，則可覆蓋基因組的約99.4%以上。

全基因組測序

分析流程

1．數據量產(chǎn)出

總堿基數量、TotalMappingReads、UniquelyMappingReads統計，測序深度分析。

2．一致性序列組裝

與參考基因組序列（Referencegenomesequence）的比對分析，利用貝葉斯統計模型檢測出每個(gè)堿基位點(diǎn)的最大可能性基因型，并組裝出該個(gè)體基因組的一致序列。

3．SNP檢測及在基因組中的分布

提取全基因組中所有多態(tài)性位點(diǎn)，結合質(zhì)量值、測序深度、重復性等因素作進(jìn)一步的過(guò)濾篩選，最終得到可信度高的SNP數據集。并根據參考基因組信息對檢測到的變異進(jìn)行注釋。

4．InDel檢測及在基因組的分布

在進(jìn)行mapping的過(guò)程中，進(jìn)行容gap的比對并檢測可信的shortInDel。在檢測過(guò)程中，gap的長(cháng)度為1~5個(gè)堿基。對于每個(gè)InDel的檢測，至少需要3個(gè)Paired-End序列的支持。

5．StructureVariation檢測及在基因組中的分布

SBC能夠檢測到的結構變異類(lèi)型主要有：插入、缺失、復制、倒位、易位等。根據測序個(gè)體序列與參考基因組序列比對分析結果，檢測全基因組水平的結構變異并對檢測到的變異進(jìn)行注釋。

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