1.原理 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。 將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當(dāng)時(shí)間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。 2.瓊脂糖凝膠電泳的儀器及試劑 儀器設(shè)備應(yīng)包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩(wěn)壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時(shí)配備紫外線檢測儀和照相系統(tǒng)。 試劑包括瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩沖液。 電泳緩沖液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0)。 溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，它可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在電泳過程中隨核酸片段遷移，將凝膠置紫外光下，插入核酸鏈中的EB在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解，應(yīng)存棕色試劑瓶中于4℃下保存。由于 EB是一種強(qiáng)的誘變劑并有中度毒性，使用時(shí)必須戴手套操作。 常用的凝膠加樣緩沖液有4種，見下表：
凝膠加樣緩沖液 |
緩沖液類型 | 6×緩沖液配方 | 貯存溫度 |
Ⅰ | | 4℃ |
Ⅱ | 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青 | 室溫 |
Ⅲ | 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青 30%（W/V）甘油水溶液 | 4℃ |
Ⅳ | 40%（W/V）蔗糖水溶液 | 4℃ |
3.凝膠的制備和電泳
操作方法如下：
(1) 用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑料盤的邊緣圈封，制成膠模，置水平工作臺上； (2) 稱取適量瓊脂糖，置電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解；
(3) 待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB貯存液，使終濃度達(dá)0.5mg/ml；
(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡；
(5) 凝膠完全凝固后，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩沖液使恰好沒過膠面約1mm； (6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中；
(7) 接通電源，使樣品槽在負(fù)極端，用1-5v/cm的電壓，電泳適當(dāng)時(shí)間；
(8) 電泳結(jié)束后，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，并拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘，再如上觀察和拍照，記錄結(jié)果。
4.凝膠攝影
操作需在暗室進(jìn)行，將相機(jī)固定好，把凝膠放在紫外檢測儀上適當(dāng)位置，調(diào)焦，裝上紅色濾光片，按常規(guī)拍照。 亦可使用凝膠自動處理系統(tǒng)，但儀器費(fèi)用較高。
5.EB溶液的凈化處理
由于EB具有一定的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對含EB的溶液進(jìn)行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。
(1) 對于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下處理：
①將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5μg/ml；
②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4 ，混勻，再加入等量的25mol/L HCl，混勻，置室溫?cái)?shù)小時(shí)； ③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH，混勻并廢棄。 (2) EB含量小于0.5μg/ml的溶液可如下處理：
① 按1mg/ml的量加入活性炭，不時(shí)輕搖混勻，室溫放置1小時(shí)； ② 用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。
聚丙烯酰胺凝膠電泳
1.原理 聚丙烯酰胺凝膠通過丙烯酰胺單體、鏈聚合催化劑N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨以及交聯(lián)劑N，N’-亞甲雙丙烯酰胺之間的化學(xué)反應(yīng)而形成。丙烯酰胺單體在催化劑作用下產(chǎn)生聚合反應(yīng)形成長鏈，長鏈經(jīng)交聯(lián)劑作用交叉連接形成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯(lián)度決定。鏈長取決于丙烯酰胺的濃度，調(diào)節(jié)丙烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度比例，可改變聚合物的交聯(lián)度。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達(dá)到分離目的，兼具分子篩和靜電效應(yīng)，分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳。可分離只相差1個(gè)核苷酸的DNA片段。 聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析和制備長度小于1kb的DNA片段。根據(jù)所要分離的核酸片段大小，可制備不同濃度的凝膠。
2.凝膠的制備和電泳 由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，灌制聚丙烯酰胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進(jìn)行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳一般采用垂直裝置。
凝膠的制備和電泳操作如下：
(1) 配制試劑
① 30%丙烯酰胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺。 ② 5×TBE 每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
③ 10%過硫酸銨：10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。
(2) 裝置膠模 將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗，并經(jīng)自來水和無離子水沖洗干凈，晾干。裝置時(shí)，將較大的玻璃板平放在工作臺上，將兩個(gè)墊條放在玻璃板兩側(cè)，涂上少量凡士林，并將上層玻璃板置于墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其余三邊應(yīng)用防水膠帶密封。 (3) 根據(jù)玻璃板大小及夾層厚薄計(jì)算所需凝膠溶液量，按下表配制溶液(100ml)。 聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制 |
濃度 | 3.5 | 5.0 | 8.0 | 12.0 | 20.0 |
30%丙烯酰胺(ml) | 11.6 | 16.6 | 26.6 | 40.0 | 66.6 |
水(ml) | 67.7 | 62.7 | 52.7 | 39.3 | 12.7 |
5×TBE(ml) | 20.0 | 20.0 | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
| 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
將35μl TEMED加入100ml混合液中，混勻，然后均勻連續(xù)注入兩玻璃板空隙中。 (4) 立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。
(5) 室溫聚合1小時(shí)，梳齒下出現(xiàn)折光帶時(shí)，表明聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或?yàn)V紙(用1×TBE浸泡)包蓋于凝膠頂部，置4℃保存1-2天。
(6) 拔去梳子，立即用水沖洗加樣孔。
(7) 除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅(qū)盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔；
(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩沖液(見表2-28)混合，并加入凝膠加樣孔中；
(9) 接通電源，正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時(shí)凝膠產(chǎn)生的熱量可造成DNA區(qū)帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈； (10) 電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作臺上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，并小心揭下凝膠，置染色液中染色并進(jìn)行結(jié)果觀察。
3.凝膠的染色和觀察 聚丙烯酰胺凝膠中核酸帶的染色，常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。
(1) 將凝膠置固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中固定10分鐘； (2) 雙蒸水洗1-2次；
(3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中，室溫反應(yīng)15-30分鐘；
(4) 充分水洗；
(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH，含1ml甲醛)中反應(yīng)至條帶顯色清晰，本底適宜； (6) 用5%冰醋酸終止反應(yīng)。
