動(dòng)物乳腺生物反應器（基于轉基因技術(shù)平臺的產(chǎn)品）

特點(diǎn)

乳腺生物反應器生產(chǎn)的外源蛋白種類(lèi)廣泛，從小分子肽到大分子復雜蛋白質(zhì)，從生物活性酶到抗體、病毒抗原蛋白均可有效生產(chǎn)。利用動(dòng)物乳腺生物反應器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)有：（1）生物活性高，無(wú)污染。動(dòng)物乳腺有完整的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，從而保證了產(chǎn)品的高生物活性。（2）易分離提純，成本低廉；現有的一些人藥物蛋白之所以昂貴，除了原料難以收集外，另一原因是分離提純極為困難成本極高。而動(dòng)物乳腺生物反應器的產(chǎn)物直接經(jīng)乳汁分泌出體外，只需用常規方法除去酪蛋白沉淀乳清，再經(jīng)層析即可得到重組蛋白，已經(jīng)建立起完整的分離純化生產(chǎn)程序。（3）產(chǎn)量高。外源基因在動(dòng)物乳腺中的表達量可以達到每升幾克到幾十克，小群轉基因大家畜的產(chǎn)量即可滿(mǎn)足全世界市場(chǎng)的需求。動(dòng)物乳腺生物反應器已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域最具開(kāi)發(fā)應用前景的尖端方向。

發(fā)展簡(jiǎn)史

轉基因動(dòng)物的研究始于20世紀80年代初。1980年，Gordon等將重組DNA用顯微注射法導入小鼠受精卵原核，首次獲得了整合有外源基因的小鼠。1982年，Palmiter等將大鼠生長(cháng)激素基因顯微注射到小鼠受精卵中，首次獲得了體重為正常小鼠2 倍以上的“超級小鼠”并提出了從轉基因動(dòng)物中提取藥物蛋白的設想。此后幾年的許多研究奠定了轉基因動(dòng)物技術(shù)體系的基礎，但真正的乳腺生物反應器研究則始于1987 年Gordon 等的工作，他們將組織型纖溶酶原激活劑（tPA）與小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的啟動(dòng)子構成重組基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表達tPA 的轉基因小鼠，同年，世界上第一只能從乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的轉基因綿羊在英國羅斯林研究所誕生。從此，開(kāi)始了乳腺生物反應器的實(shí)用性研究。

Simons等（Simons等，1987年）將帶MT啟動(dòng)子的β-乳球蛋白-凝血因子IX（BLG-FIX）、BLG-AAT 等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中，獲得了在乳汁中有外源基因表達的轉基因后代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-IX和AAT-cDNA 融合質(zhì)粒注入小鼠及綿羊受精卵中，獲得乳汁中含F-IX 和AAT 的轉基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調控區與人AAT基因相連，獲得了 4 只轉基因綿羊。Velander 等利用WAP 基因啟動(dòng)子與人蛋白質(zhì)C（hPC）cDNA 重組基因獲得的轉基因豬，重組hPC的表達量（1g/L）比人血中hPC　濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啟動(dòng)子引導tPA在山羊乳汁中得到表達（1-3g/L）。Wilmut等（Wilmut等，1997年）首創(chuàng )體細胞克隆技術(shù)并成功構建了表達人F-IX的轉基因克隆綿羊。2000年，英國PPL 公司將人類(lèi)AAT 基因定點(diǎn)整合到胎兒成纖維細胞的前膠原基因座，用轉基因細胞生產(chǎn)的轉基因打靶綿羊（McCreath等；2000年）；2001年，他們又利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)出了AAT、3-GT 和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出，乳腺生物反應器研究從模式動(dòng)物——小鼠的轉基因開(kāi)始，逐步建立起了大動(dòng)物乳腺生物反應器制備的技術(shù)平臺。

我國的施履吉院士在20世紀80年代初就提出了乳腺生物反應器的構想并獲得了表達乙肝病毒表面抗原的轉基因兔。1996 年10 月，復旦大學(xué)遺傳所和上海醫學(xué)遺傳所合作成功地獲得了表達有活性的F-IX蛋白的轉基因小鼠和5只轉基因綿羊，真正開(kāi)始了我國的乳腺反應器構建工作。1998年，上海醫學(xué)遺傳研究所構建成以牛酪蛋白基因啟動(dòng)子驅動(dòng)F-IX基因表達的表達載體，顯微注射到山羊受精卵的雄原核，成功制備了5頭轉基因羊。上海醫學(xué)遺傳研究所于1999年2月，得到一頭帶有人血清白蛋白基因的轉基因牛。2000年，中國農大和北京興源生物科技中心合作，將改造的人AAT 基因顯微注射到山羊受精卵原核中，獲得了3只帶有人AAT 的轉基因山羊。2005年青島森淼公司與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等科研院所聯(lián)合開(kāi)展，選用嶗山奶山羊完成了人的乙肝表面抗原、抗凝血酶AT-Ⅲ、人β-干擾素等三種轉基因載體的構建，并完成了羊胎兒成纖維細胞株的建立，應用細胞核移植技術(shù)成功獲得了克隆奶山羊。近幾年來(lái)的成功報道仍限于顯微注射等常規方法，離國外尚有一定差距。

表達載體

制備乳腺生物反應器的關(guān)鍵是保證目的蛋白特異性在乳腺中的高效表達，傳統表達載體都是選用某種乳蛋白基因的調控序列作為啟動(dòng)子元件。目前，已經(jīng)克隆并用作構建載體的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白（BLG）基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清白蛋白基因。

目的基因

十多年來(lái)，已有數種高價(jià)值的產(chǎn)品在大動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出來(lái)，于小鼠乳腺中獲得表達的產(chǎn)品更是多達數百種。從國際大公司開(kāi)發(fā)的情況可以看出，高經(jīng)濟價(jià)值的醫用蛋白和營(yíng)養蛋白是重要的研發(fā)對象，如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶等都已進(jìn)入了三期或二期臨床試驗階段。選擇目的基因應當首先考慮那些正常情況下來(lái)源困難或濃度低，其他表達系統難以生產(chǎn)且I臨床應用前景廣闊的蛋白基因。可以預見(jiàn)，由于細胞工程和基因治療技術(shù)的發(fā)展，細胞因子類(lèi)產(chǎn)品將不會(huì )通過(guò)動(dòng)物乳腺反應器生產(chǎn)，而用途更廣、需求量更大的治療性抗體、營(yíng)養蛋白和工程酶將成為制備乳腺生物反應器的首選靶蛋白。另外，若能建立起穩定的轉基因家畜群，以乳腺反應器生產(chǎn)基因工程疫苗，不僅生產(chǎn)效率可觀(guān)，而且可直接以乳汁進(jìn)行臨床免疫，達到方便快捷的目的。

關(guān)鍵技術(shù)

現有的應用于動(dòng)物乳腺生物反應器制備的轉基因技術(shù)主要有：

1 顯微注射法

2 逆轉錄病毒介導法

3 配子介導法

4 胚胎干細胞（ES）介導法

5 核移植介導法

還有利用同源重組原理發(fā)展起來(lái)的基因打靶（敲除）技術(shù)，結合體細胞克隆，正成為動(dòng)物乳腺生物反應器制備的新研究熱點(diǎn)。

問(wèn)題展望

在乳腺反應器研制中尚存在下述待解決的難題：（1）轉基因動(dòng)物的成功率低。（2）目的蛋白的表達水平遠低于乳汁中總蛋白含量。（3）目的基因的分離、改造、載體構建、體細胞克隆等技術(shù)環(huán)節還不夠成熟。（4）“位置效應”與“劑量效應”目前無(wú)法克服。（5）乳汁蛋白基因表達調控機理、目的基因在宿主染色體上整合的詳細機制、基因表達調控元件在不同家畜表現差異的原因、乳腺細胞對蛋白質(zhì)的加工修飾機理等還未弄清。（6）產(chǎn)品的安全性的問(wèn)題，外源基因侵入對動(dòng)物和基因藥物對人體正常功能有何影響，否會(huì )造成基因污染，尚難定論。

雖有這些問(wèn)題存在，但許多國家政府和大型制藥企業(yè)仍競相投入巨資資助乳腺生物反應器產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，使乳腺反應器研制和產(chǎn)業(yè)化呈現日益加速的趨勢。利用乳腺反應器生產(chǎn)營(yíng)養活性蛋白，如需求量極大的護膚品中的活性蛋白，或者改造奶質(zhì)而使其具備營(yíng)養和藥用雙重功能，或者直接生產(chǎn)口服生物制品，都具有極大的市場(chǎng)潛力。我們相信乳腺生物反應器產(chǎn)業(yè)不僅會(huì )成為有高額利潤回報的新型行業(yè)，而且將會(huì )帶動(dòng)整個(gè)國民經(jīng)濟的發(fā)展，形成全新的產(chǎn)業(yè)結構模式。因此，我們應當抓住機遇，增加投資力度，大力興辦乳腺反應器產(chǎn)業(yè)，以在未來(lái)的生物高技術(shù)競爭中奪得主動(dòng)權。