正文
技術(shù)原理
從生物樣本，如組織、血液、痰液中提取核酸（DNA、RNA），制備相應的模板、引物，進(jìn)行多重PCR，然后采用凝膠電泳、PAGE電泳、HPLC、DHPLC、毛細管電泳等方法中的一種進(jìn)行DNA片段分析，最后將獲得的數據進(jìn)行處理。
先進(jìn)片段分析（Advanced fragment analysis，AFA），是片段分析中較為領(lǐng)先的技術(shù)。原理是設計針對不同目標靶點(diǎn)的引物，每個(gè)靶點(diǎn)擴增得到的產(chǎn)物至少有1bp以上的差別。交第三方合成引物并在末端標記熒光，不同大小片段采用不同顏色熒光標記，進(jìn)行多重聚合酶鏈反應（PCR），使得所有靶點(diǎn)的核酸片段都帶熒光標記（圖A）。產(chǎn)物預處理后，進(jìn)行毛細管電泳，利用熒光檢測器對不同片段大小的產(chǎn)物進(jìn)行識別和區分（圖B）。使用軟件分析數據來(lái)決定以下結果：
1）大小：分析軟件利用每種樣品中的標準尺寸為每種樣品創(chuàng )建一條標準曲線(xiàn)，
然后通過(guò)熒光標記片段與標準曲線(xiàn)的比較獲得片段的相對大小。
2）基因型：分析軟件根據用戶(hù)自定義的基因位點(diǎn)來(lái)分配等位基因。
FA操作過(guò)程
FA發(fā)展歷史
a) 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質(zhì)，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。遷移速度與核酸分子本身的大小和構型有關(guān)，相同電場(chǎng)強度下，分子量較小的DNA分子遷移較快。
瓊脂糖凝膠分離DNA片段大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(cháng)度從200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率雖比PAGE電泳低，但它制備容易。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。裝置如圖所示：
1.PAGE電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠為三維網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應。
聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辨力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。
1.HPLC|DHPLC
高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現對試樣的分析。
變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography \ DHPLC），在部分變性的條件下，通過(guò)雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，發(fā)現DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來(lái)，在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線(xiàn)。
DHPLC是一種基因突變篩查技術(shù)，能夠自動(dòng)化、高通量進(jìn)行，且除PCR之外，勿需進(jìn)行PCR引物修飾、購買(mǎi)特殊試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。DHPLC靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長(cháng)度變動(dòng)范圍廣、相對價(jià)廉。檢測每個(gè)樣品只需要8分鐘左右，且能夠純化DNA片斷。只能檢測雜合突變是DHPLC的不足之處，但是可以通過(guò)純合突變樣品和野生型樣品混合的方法來(lái)解決。
1.毛細管電泳
毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱(chēng)高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一類(lèi)以毛細管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。毛細管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內容，它使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平。
毛細管電泳通常使用內徑為25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管。具有：高效、快速、微量、儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化、操作方便、應用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
FA技術(shù)特點(diǎn)
傳統的基因片段分析建立在凝膠電泳基礎上，利用片段大小以及電荷不同對核酸產(chǎn)物進(jìn)行分離和分析，盡管應用普遍、成本較低，但是卻存在以下缺點(diǎn)：操作繁瑣；分辨率低，無(wú)法精確度量基因片段的堿基數；有EB污染，嚴重危害人類(lèi)健康。
先進(jìn)FA檢測技術(shù)的核心內容是多重PCR技術(shù)以及毛細電泳系統分離。在同一個(gè)PCR反應體系中包含多對引物，各引物特異性地結合相應的目的基因，進(jìn)行多重PCR；通過(guò)毛細管電泳系統可對不同片段長(cháng)度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和識別，同時(shí)，根據峰面積的大小還可對不同產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。先進(jìn)FA包含以下幾種先進(jìn)的技術(shù)：
1.高特異性等位基因多重分析（Multiplexing Allele Specific Assay, MASA）：能在一個(gè)反應中同時(shí)分析多達15個(gè)SNP位點(diǎn)，可用于藥物基因組學(xué)分析；
2.高靈敏度高特異性病原體分析（High Sensitivity Pathogen Specific, HSPS）：在一個(gè)反應體系里面同事檢測與識別多個(gè)低拷貝數的病原體，用于感染性病原體的多重檢測。
傳統PCR僅應用一對引物，通過(guò)PCR擴增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。
多重PCR特點(diǎn)：①高效性，在同一PCR反應管內同時(shí)檢出多種病原微生物，或對有多個(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體.②系統性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時(shí)偵檢.③經(jīng)濟簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應管內同時(shí)檢出，將大大的節省時(shí)間，節省試劑，節約經(jīng)費開(kāi)支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。
毛細管電泳特點(diǎn)：容積小（一根100 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL）；側面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場(chǎng)（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。
由此，可使毛細管電泳具備如下優(yōu)點(diǎn)：
（1）高效：塔板數目在10-10 片/m 間，當采用CGE 時(shí)，毛細管電泳色譜圖，塔板數目可達10 片/m 以上；遠高于高效液相色譜；
（2）快速：一般在十分鐘內完成分離，快的僅需三分鐘；
（3）微量：進(jìn)樣所需的樣品體積為nL 級；
（4）儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化；
（5）操作方便；
（6）應用范圍廣。
與直接測序相比：某一個(gè)基因位點(diǎn)是比較容易得知的，但要獲得一段完整的基因序列就很困難，若是得不到就無(wú)法進(jìn)行直接序列比較。而如果標記離基因位點(diǎn)很近，那么可以通過(guò)標記分析推斷出突變基因的存在。標記分析要比直接基因測序快很多。
FA相關(guān)應用介紹
a) 臨床方面
i. 病原微生物
片段分析能夠準確、快速地檢測出致病的病原微生物。
按照疾病傳播途徑的不同，大致可以分為：蟲(chóng)媒、呼吸道、寄生蟲(chóng)、接觸、胃腸道、血液等。片段分析在這幾類(lèi)疾病的病原微生物診斷應用中的成效顯著(zhù)。例如，Jian Li, Yanhui Zhang等人研究了瘧原蟲(chóng)的簡(jiǎn)單重復序列（SSRs），區分了近600種用多態(tài)微衛星標記的約氏瘧原蟲(chóng)基因組。
除了對傳播瘧疾的瘧原蟲(chóng)的研究，片段分析還被廣泛地用于呼吸道疾病的研究，如麻疹病毒、致肺結核的分支桿菌、水痘病毒、H1N1流感以及雞瘟病毒等。Maria A. Nagel, Don Gilden等人運用逆轉錄PCR技術(shù)和基因圖譜分析系統（GeXPS）以及毛細管電泳和熒光分析技術(shù)，克服了宏陣列和微陣列分析不能檢測潛伏在人神經(jīng)中樞的水痘帶狀皰疹病毒（VZV）基因的缺點(diǎn)，該技術(shù)能夠快速分析VZV在人神經(jīng)系統潛伏期時(shí)的所有基因轉錄。除了上述幾位研究人員，Meng Qin, Da-yan Wang等人也運用了GeXP基因分析系統研究了H1N1流感病毒，研究發(fā)現該方法具有較高的靈敏度和特異性，并且該法可以用來(lái)檢測潛伏的混合感染，為流行性感冒的監管提供了強有力的方法，同時(shí)也提供了一個(gè)研究相似病原體變異的平臺。而Jin Li, Nai-Ying Mao等人運用多重逆轉錄PCR技術(shù)和GeXP系統，對16種人呼吸道病毒進(jìn)行了同時(shí)檢測，結果顯示這是一種快速的、高成本效益的、靈敏的、具有特異性且高通量的檢測呼吸道病毒感染的方法。
片段分析在寄生蟲(chóng)方面也有研究應用。如利什曼蟲(chóng)， Rolando Oddone,Carola Schweynoch等人運用多位點(diǎn)微衛星分型分析技術(shù)（MLMT）根據15個(gè)獨立位點(diǎn)來(lái)識別利什曼蟲(chóng)，結果證明MLMT適用于利什曼蟲(chóng)亞屬的流行病學(xué)和菌株群體遺傳學(xué)的研究。
通過(guò)接觸傳播的如腺病毒、人乳頭瘤病毒（HPV）等。低危性HPV引發(fā)扁平疣、尋常疣等疣，高危性HPV引發(fā)陰莖癌、宮頸癌、直腸癌等癌癥。Meng-Jie Yang, Le Luo等人采用多重PCR和GeXP分析儀對11種人乳頭瘤病毒（其中包括9中高危型和2種低危型）進(jìn)行檢測，結果表明GeXP-PCR是一種快速、高靈敏度、高通量的檢測多種HPV感染的方法。國內也有人運用GeXP-PCR對HPV進(jìn)行檢測，如蘆春斌，楊夢(mèng)婕等人利用該技術(shù)對5種不同亞型的HPV病毒進(jìn)行檢測鑒別。
胃腸道傳播疾病方面研究如與手足口病的腸道病毒相關(guān)的檢測。目前已有的檢測方法有實(shí)時(shí)逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、內嵌套式PCR、限制性片段長(cháng)度多態(tài)性-聚合酶鏈式反應（PCR-RFLP），這些方法都能夠鑒別不同血清的腸道病毒，然而實(shí)時(shí)RT-PCR和內嵌套式PCR只能檢測有限數量的血清，PCR-RFLP盡管能夠同時(shí)檢測多個(gè)血清樣本，可是價(jià)格卻比較貴，也很耗時(shí)耗人力，因此Xiumei Hu, Yong Zhang等人研究認為GeXP分析法是一種快速、低成本、高通量區分9種手足口病腸道病毒血清型的方法。
通過(guò)血液傳播的疾病如艾滋病、乙肝、丙肝等。它們均是由病毒引起的疾病，通過(guò)片段分析來(lái)檢測艾滋病病毒（人體免疫缺陷病毒HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等病毒的研究也有不少。肖信研究建立了用于廣西HIV-1流行毒株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并對方法科學(xué)性進(jìn)行評價(jià)，結果表明熒光定量PCR方法具有線(xiàn)性范圍廣，特異度高，重復性好，檢測下限低，檢測試劑穩定性好，并與國際標準的NASBA法檢測結果高度相關(guān)，與國內標準的試劑盒產(chǎn)品具有較好的一致性，能適應廣西地區不同HIV-1亞型；該方法實(shí)用、可行，在病毒載量檢測、早期感染檢測、治療病人的耐藥監測等方面具有良好的應用前景。尹菊囡采用多重巢式PCR技術(shù)研究構建一種快速、經(jīng)濟、實(shí)用、可靠的同步檢測HBV、HCV和HIV-1的方法，結果表明該方法可同時(shí)檢測HBV、HCV和HIV-1,但其靈敏度和特異度需進(jìn)一步鑒定。李桂明采用磁珠提取核酸技術(shù)建立了一種能同時(shí)檢測、鑒定和定量三種病毒的多重實(shí)時(shí)定量RT PCR檢測方法，將這種方法的靈敏度與Qiagen公司的病毒DNA和RNA提取試劑盒進(jìn)行比較，結果表明它們有很好的相關(guān)性；且一種病毒核酸的擴增不會(huì )對其它兩種產(chǎn)生影響；該檢測體系具有很高的靈敏度，最低可達50拷貝/ml；與單重的檢測相比也顯示出很好的相關(guān)性；表明這種檢測體系有大規模用于獻血篩查的潛力。
ii. 個(gè)體化用藥
個(gè)體化藥物用藥是根據病人的年齡、身高體重、遺傳特征等因素，選擇適合病人的藥物種類(lèi)和劑量，來(lái)顯著(zhù)提高藥物療效并減少藥物毒性的一種用藥方案。
統計數據表明，絕大多數藥物在約1/3的使用者中不能取得滿(mǎn)意療效，約1/6的使用者發(fā)生不同程度的不良反應，總的安全有效率僅約50%。目前藥物不良反應是人類(lèi)第五大死亡原因。為在基因組學(xué)的基礎上，通過(guò)將基因表達或單核苷酸的多態(tài)性與藥物的療效或毒性聯(lián)系起來(lái)，研究藥物如何由于遺傳變異而產(chǎn)生不同的作用，被稱(chēng)為藥物基因組學(xué)。迄今已有100余種藥物經(jīng)美國FDA批準貼上了遺傳標簽，用于提示不同基因型的患者在應用該藥物時(shí)可能產(chǎn)生的療效和毒性。因此，通過(guò)基因檢測可針對性地為每位患者“量身定做”一套最適合的治療方案，從而最大程度地提高治療的有效率，減少藥物的毒副作用，避免用藥不當貽誤時(shí)機。
片段分析技術(shù)被廣泛應用于腫瘤領(lǐng)域，包括乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌等。有卵巢癌病史的家族中常伴隨著(zhù)BRCA1以及BRCA2基因突變，Herman等人通過(guò)多重連接探針擴增技術(shù)（MLPA ）分析BRCA1基因，對產(chǎn)物大小進(jìn)行分析，意外的發(fā)現了在該基因的外顯子11有一段374bp的序列缺失，然而用傳統的測序法并未發(fā)現該現象。Pham等人通過(guò)小發(fā)夾狀RNA干擾乳腺癌干細胞的CD44，利用多重PCR結合片段分析法，經(jīng)GeXP遺傳分析儀對干細胞相關(guān)基因的基因表達水平進(jìn)行了研究，發(fā)現通過(guò)干擾CD44，會(huì )使得乳腺癌干細胞向非乳腺癌干細胞分化，基因表達水平也更相似，這為乳腺癌的治療提供了一種新的潛在的治療方法。Sadava等人研究靈芝對小細胞肺癌的療效，利用GeXP基因表達分析系統對與細胞循環(huán)及細胞凋亡相關(guān)的36個(gè)基因進(jìn)行了分析，發(fā)現其中經(jīng)靈芝處理后的9個(gè)基因的表達水平與經(jīng)化療藥物依托泊苷以及阿霉素治療后的不同。Dahan等人通過(guò)限制性片段長(cháng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術(shù)以及CEQ的分型研究了與用于治療結腸直腸癌的西妥昔單抗藥效相關(guān)的潛在基因EGFR、EGF、CCND1、FCGR2A和FCGR3A的多態(tài)性，研究發(fā)現FCGR3A F158V以及CCND1 A870G的多態(tài)性對預測藥效、總生存數具有獨立重大的意義。Drew等人利用GeXP多重基因表達分析系統、微陣列芯片法及實(shí)時(shí)熒光定量法對結腸普通組織、息肉及腫瘤組織的炎癥相關(guān)基因的表達水平進(jìn)行了研究，結果表明GeXP表達譜分析法可實(shí)現同時(shí)對多個(gè)基因表達進(jìn)行定量，相比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，它更快速、價(jià)格更低，同時(shí)多個(gè)內參基因能確保基因表達水平的準確性。
在心血管疾病方面，也有用到片段分析方法進(jìn)行相關(guān)研究。腎胺酶抗體具有血流動(dòng)力學(xué)效應，它很可能參與調節心血管功能，Buraczynska等人通過(guò)PCR-RFLP方法對腎胺酶抗體基因上的3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型發(fā)現該基因的多態(tài)性與糖尿病第二類(lèi)患者的高血壓相關(guān)，并發(fā)現rs10887800的等位基因G很可能會(huì )增加糖尿病患者中風(fēng)的風(fēng)險。LDLR基因的突變是家族性高膽固醇血癥最常見(jiàn)的病因，而大片段基因重組在LDLR基因突變中所占比例高達10%，Goldmann等人利用MLPA方法首次發(fā)現非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）參與LDLR的基因重組。Botto等人利用測序并結合PCR-RFLP方法，研究LMNA基因的突變，該基因突變與擴張型心肌病密切相關(guān)，研究發(fā)現了在最常見(jiàn)的R190W突變旁邊有一類(lèi)新的錯義突變R189W。張陽(yáng)東等人還通過(guò)GeXP平臺對冠心病相關(guān)基因表達分析中的管家基因的表達水平進(jìn)行了比較，并提出β-actin和SRP14可作為檢測CAD相關(guān)基因表達水平的內參基因。寧波海爾施基因科技有限公司也非常關(guān)注心血管疾病相關(guān)研究，在A(yíng)FA技術(shù)上開(kāi)發(fā)了多項專(zhuān)利，如“一種指導華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法”已被授權，通過(guò)對藥物靶標及參與藥物代謝等基因的遺傳多態(tài)性的診斷，用于華法林抗凝的安全性指導；同時(shí)，還開(kāi)發(fā)了針對β-受體阻斷藥用藥、噻嗪類(lèi)利尿藥降壓藥以及血管擴張藥硝酸甘油的多重基因檢測試劑盒，目前正在審核過(guò)程中。
片段分析方法還被用于其它疾病的研究，如淋巴細胞性白血病、肌萎縮、抑郁癥等。
iii. HLA分型
在組織或器官移植中供者與受者之間相容(不排斥)還是不相容(排斥)都是由它們組織特異性所決定的。這種代表個(gè)體特異性的組織抗原稱(chēng)組織相容性抗原，一套這樣的抗原系統稱(chēng)主要組織相容性系統(major histocompatibility system,MHS)。編碼MHS的基因群稱(chēng)為主要組織相容性復合體MHC。人的MHC就稱(chēng)HLA(human leukocyte antigen)，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復合體。 HLA包括有I類(lèi)II類(lèi)和III類(lèi)基因部分。實(shí)踐證明，HLA相同的同胞供者的腎移植，90%以上效果良好；單體型不同的供者，效果明顯下降；兩單型皆不同者則很少存活。
以往，用于HLA分型的方法主要是血清學(xué)和細胞學(xué)方法，由于其方法學(xué)上的缺點(diǎn)，分型的準確性較差，且不能進(jìn)行亞型分析。最近幾年，隨著(zhù)分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，特別是PCR技術(shù)的廣泛應用，HLA基因分型技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，各具特點(diǎn)的不同HLA基因分型技術(shù)不斷出現，在方法學(xué)上達到了穩定、準確、精細、簡(jiǎn)便、實(shí)用的程度，為其臨床推廣應用奠定了技術(shù)基礎。鄔于川等人應用PCR-RFLP（限制性片段長(cháng)度多態(tài)性）方法進(jìn)行了HLA-DP B1 等位基因與四川漢族人哮喘的相關(guān)性研究。黃飛等人進(jìn)行PCR-SSP(序列特異性引物)/PCR-SBT-HLA(直接測序分型) 高分辨等位基因分型比較，發(fā)現兩種方法具有實(shí)驗互補意義。若同時(shí)應用兩種方法能夠有效改善HLA 等位基因高分辨分型的準確性和重復一致率。
值得注意的是，目前臨床用血多為成分輸血，成分血分離自全血，不可避免會(huì )殘留少量白細胞或血小板。而有核細胞或血小板表面存在的HLA會(huì )隨著(zhù)輸血進(jìn)入患者體內，異體HLA抗原可對患者的HLA分型判定產(chǎn)生干擾。現報道1例接受過(guò)多次大量成分血輸注治療的重型再生障礙性貧血患者，由于未嚴格按HLA分型血標本規定時(shí)間間隔進(jìn)行血標本采集，導致HLA低分辨基因分型結果無(wú)法判定。
1.親權鑒定
古代滴血認親的方法，造成了不少冤案。如今，有了片段分析法，就可以快速、準確的鑒定親權關(guān)系。
楊玉發(fā)等人，采用PCR復合擴增技術(shù)、毛細管電泳及五色熒光自動(dòng)化檢測技術(shù)對143例親權鑒定案例389份血液樣本，進(jìn)行了15個(gè)STR基因位點(diǎn)和1個(gè)Amelogenin性別基因位點(diǎn)檢測分析，得出結論：STR基因檢測位點(diǎn)多，多態(tài)性高,DNA片段短、造成錯配和優(yōu)先擴增的可能性小，提高了PCR擴增的成功率和靈敏度，而且標本用量少(一般僅為0.1ng模板DNA),因此,STR基因位點(diǎn)檢測技術(shù)可以作為親權鑒定的主要技術(shù)手段。潘猛等人，取2011~2012年來(lái)自江蘇省的262份無(wú)血緣關(guān)系的漢族個(gè)體，對24個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行復合擴增,ABI3130自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行片段分析并進(jìn)行基因分型，分析了24個(gè)Y染色體短串聯(lián)重復序列(STR)基因座在江蘇漢族群體的基因多態(tài)性、基因頻率和其他地域人群之間的遺傳距離。
1.其他方面
產(chǎn)前診斷、個(gè)體識別等
