概括介紹

原位雜交早在1969年開(kāi)始使用，并于1981年開(kāi)始用于RNA 的原位雜交檢測[1, 2] 。

RNA原位雜交方法有：

傳統RNA 原位雜交

Isotopic ISH

使用放射性標記的RNA探針進(jìn)行的。Isoptopic ISH 可以達到高敏感性，但是需要很長(cháng)的曝光時(shí)間（數天到數周），同時(shí)只提供有限的形態(tài)學(xué)數據。該種雜交方法由于使用的探針很長(cháng)，曝光時(shí)間也很長(cháng)，所以存在非特異性雜交以及長(cháng)時(shí)間曝光導致與高背景干擾信號產(chǎn)生。由于以上問(wèn)題以及放射性污染，從而限制了此項技術(shù)的普遍應用。

非-ISOTOPIC ISH

熒光標記或者生物素寡核苷酸探針的應用極大程度地促進(jìn)了RNA原位雜交的應用，該方法縮短了實(shí)驗時(shí)間，同時(shí)達到了放射性探針的雜交敏感性。這類(lèi)探針可以在雜交后通過(guò)熒光或者可見(jiàn)光酶促反應成像。作為一種DNA探針的替代物，RNA探針使用ribo探針，該探針可以通過(guò)體外轉錄產(chǎn)生，通常有幾百個(gè)堿基。與DNA寡核苷酸探針相比，ribo探針可以和目標RNA形成更加穩定的雜交，從而允許使用高強度的洗脫條件來(lái)增加非特異性。但是，由于RNA的天然特性，使得該類(lèi)探針的標記物位點(diǎn)有限，由于存在非特異性結合導致較高的非特異性雜交，導致DNA 寡核苷酸探針與RNA riboprobes 探針的信噪比無(wú)法有效控制。另外，在檢測靈敏度上也有一定局限。對于低水平表達或者部分降解的RNA，不能做到很好的檢測。

直接法RNA 原位雜交

直接檢測RNA 原位雜交方法，例如目前市場(chǎng)上Biosearch 公司（Stellaris ? , Biosearch TechnologiesPetaluma, CA）使用直接熒光標記的小的單鏈寡核苷酸探針。多個(gè)探針設計針對每個(gè)目標RNA，每個(gè)與一小段序列互補，它們結合延伸至整個(gè)序列的長(cháng)度。以這種方式，使用多個(gè)探針可以確保提高靈敏度，并且在不可避免的一個(gè)或兩個(gè)探針?lè )翘禺愋噪s交背景下熒光信號足以觀(guān)測到。由于直接檢測標記的探針，這項技術(shù)是簡(jiǎn)單而快速的。然而，該技術(shù)的靈敏度和信噪比仍然很局限，需要專(zhuān)門(mén)的去背景算法進(jìn)行結果分析。

新一代RNA原位雜交

RNAscope? 原位雜交

RNAscope?專(zhuān)利技術(shù)是近年來(lái)最火的RNA原位雜交技術(shù)，是RNA原位雜交（ISH）領(lǐng)域的一項重大進(jìn)步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）開(kāi)發(fā)，通過(guò)專(zhuān)利的雙“Z”探針設計和信號放大系統，使RNA原位雜交具有高度特異性、單分子檢測的敏感性并有極高的信噪比，能夠在單細胞水平同時(shí)定量多個(gè)RNA的表達，在獲得單細胞中單拷貝RNA表達數據的同時(shí)提供完整的組織形態(tài)學(xué)信息。

RNAscope 方法克服了以前的RNA原位雜交技術(shù)的非特異性雜交、靈敏度低、對樣本要求高等弱點(diǎn)，可替代傳統的ISH/FISH RNA 原位檢測，同時(shí)單分子檢測靈敏度提供了在組織細胞原位對單個(gè)細胞中基因的表達進(jìn)行檢測，釋放RNA作為生物標記的全部潛能，提高對疾病與標志物之間復雜的生物學(xué)相關(guān)性的認識，是理想的能夠用于NGS和芯片技術(shù)后期轉化研究技術(shù)平臺。

RNAscope? 原位雜交步驟：

RNAscope?原位雜交是一項新穎的用于檢測位于組織細胞原位的目標RNA的原位雜交（In Situ Hybridization，ISH)檢測技術(shù)。該技術(shù)進(jìn)行RNA原位雜交檢測主要分成5步。

Step 1：

透化：通過(guò)RNAscope?預處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細胞，暴露目標RNA。

Step 2：

探針雜交：針對靶基因設計RNAscope?專(zhuān)利Z型探針與目標RNA雜交。

Step 3：

信號放大：RNAscope?檢測試劑盒逐級信號放大。

Step 4：

信號可視化：在普通光學(xué)顯微鏡或者多光譜熒光成像系統下，每一個(gè)目標RNA分子以一個(gè)點(diǎn)狀信號的形式呈現。

Step 5：

量化分析：顯微鏡下直接計數或者使用圖像分析軟件如RNAscope? SpotStudio? 或HALO對每一個(gè)細胞中的RNA單分子信號進(jìn)行精確定量分析。